“關-開”型近紅外熒光探針用于鐵離子和黑茶抗氧化活性測定

王貞睿 齊風佩* 羅 苗 曹一鳴 劉洪濤蘇建科 張常青 龍立平 劉長輝*,2

1(湖南城市學院材料與化學工程學院, 黑茶金花湖南省重點實驗室，益陽 413000)2(湖南大學化學生物傳感與計量學國家重點實驗室，長沙 410082)

1 引 言

鐵是生命體中不可或缺的微量元素之一，也是血紅蛋白、血紅素、多種酶和免疫系統的重要組成部分。鐵元素在質子轉移、細胞新陳代謝、酶催化反應及氧的運輸與儲存等生理過程中發揮著重要的作用[1,2]。然而，人體內鐵元素的缺乏會導致生理系統紊亂，而攝入過量的鐵也會誘發心臟病、貧血癥、糖尿病及腎衰竭等多種疾病，甚至死亡[3～5]。工農業生產中廣泛使用的鐵會造成環境污染，因此Fe3+的檢測對環境監控及人類健康具有非常重要的意義。目前，文獻報道的Fe3+檢測方法主要有比色法[6,7]、伏安法[8]和原子吸收光譜法[9]等。與上述檢測方法相比，熒光分析法具有靈敏度高、選擇性好、信號可調、廉價、操作簡便等優勢[10,11]。由于Fe3+的順磁性，鐵離子熒光探針大都屬于熒光淬滅型，易受其它淬滅過程的干擾，造成假“陽性”結果[12]。此外，大部分“關-開”型鐵離子熒光探針的發射光處在短波長區域，容易受到環境的影響[13～19]，而近紅外熒光探針具有背景干擾低、信噪比高等優勢，可提高檢測的準確度[15,16,20,21]。因此，發展高靈敏、高選擇性的熒光增強型近紅外熒光探針檢測Fe3+具有非常重要的意義。

茶葉中的黃酮、兒茶素等抗氧化性物質能有效抑制活性氧的形成，具有良好的抗氧化活性[20]，其測定方法主要有清除自由基能力法[21]、氧化自由基吸收能力法[22]及鐵離子還原法[23]。其中，鐵離子還原法是基于Fe3+被還原為Fe2+后與三吡啶三嗪(TPTZ)絡合引起吸光度的變化來檢測抗氧化活性[23]。然而，分光光度法的靈敏度偏低。因此，開發高靈敏的分析方法檢測茶葉的抗氧化活性具有非常重要的意義。

圖1 CyQ-Cys探針的構建及其對鐵離子的響應機理Fig.1 Chemical construction of CyQ-Cys probe and fluorescent response towards Fe3+

據文獻報道，金屬離子可與生物硫醇如谷胱甘肽(GSH)及半胱氨酸(Cys)分子中的羧基、氨基和巰基配位[17,24]，從而改變檢測體系的光學信號，實現對金屬離子的檢測。本研究通過簡單方法合成喹啉類花菁染料(CyQ)，利用鹵素-巰基的親核取代及重排反應共價結合Cys[25,26]，進一步合成了近紅外熒光探針(CyQ-Cys)，可高選擇性、快速識別Fe3+(見圖1)。同時，基于Fe3+介導的“關-開”策略，構建了一種黑茶抗氧化活性檢測方法。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

F-4500熒光分光光度計、UV-3100 紫外-可見分光光度計(日本Hitachi公司)； Varian INOVA400核磁共振儀(美國Varian公司)；HP1100LC/MSD質譜儀(美國Agilent公司)。

4-甲基喹啉、碘乙烷、金屬離子的高氯酸鹽均購自美國Sigma-Aldrich公司； 其余化學試劑均為國產分析純；實驗用水為二次蒸餾水。

2.2 實驗方法

2.2.1化合物CyQ的制備參考文獻[27]方法，將0.432 g(2.5 mmol) 4-甲基-N-乙基喹啉、0.338 g(1.0 mmol)N-[(3-(苯胺基亞甲基)-2-氯-1-環己烯-1-基)亞甲基]苯胺鹽酸鹽及0.205 g(2.5 mmol)無水醋酸鈉溶于15 mL乙醇中，在氮氣保護下于80℃反應1 h。冷卻后，旋蒸除溶劑，然后在氯仿/醋酸鈉溶液中攪拌1 h，過濾，真空干燥，柱層析分離(展開劑為甲醇/二氯甲烷，V/V，1:19)，得棕紅色固體0.286 g，產率47.2%。1H NMR (400 MHz, DMSO-D6)δ: 1.38( t, 3H), 1.52(t, 3H), 1.68(m, 2H), 2.76 (m, 4H), 4.58(q, 2H), 4.85(q, 2H), 5.45(d, 1H), 6.15(s, 1H), 6.52(d, 1H), 6.63(s, 1H), 6.72～7.30(m, 5H), 8.12～8.62(m, 6H), 9.85(d, 1H)。13C NMR (100 MHz, DMSO-D6)δ: 165.3, 146.8, 145.3, 144.0, 140.8, 139.3, 137.7, 136.2, 133.0, 130.4, 128.4, 126.1, 125.5, 124.8, 123.8, 118.6, 118.0, 116.1, 108.2, 58.6, 49.3, 30.3, 27.6, 25.1, 16.5, 14.3。 MS,m/z: 480.23[M]+, 理論計算值, 479.22。合成路線見圖2。

圖2 CyQ的合成路線Fig.2 Synthesis route of CyQ

2.2.2探針CyQ-Cys的制備化合物CyQ用DMF配成10 μmol/L溶液，Cys用水配成200 mmol/L溶液。將400 μL 10 μmol/L CyQ溶液、適量Cys溶液和5.0 μL PBS緩沖液(10 mmol/L，pH 7)混合均勻，用DMF稀釋至 500 μL。孵育3 min后，用熒光分光光度計記錄熒光信號的變化，激發光和發射光的狹縫寬度均為10 nm，電壓為 500 V，激發波長為460 nm，平行測試3次。

2.2.3選擇性實驗金屬鹽用去離子水配成1.0 mmol/L溶液，備用。在熒光池中加入500 μL上述CyQ-Cys溶液，測其熒光發射光譜，然后加入不同金屬離子溶液，孵育3 min后，用熒光分光光度計記錄熒光信號變化，激發光和發射光的狹縫寬度均為10 nm，電壓為 500 V，激發波長為460 nm，平行測試3次。

2.2.4Fe3+的檢測在熒光池中加入500 μL上述CyQ-Cys溶液，測其熒光發射光譜，然后加入不同濃度的Fe3+溶液，用熒光分光光度計記錄熒光信號的變化，激發光和發射光的狹縫寬度均為10 nm，電壓為 500 V，激發波長為460 nm，平行測試3次。

2.2.5實際樣品的檢測準確稱取10 g未處理的(毛茶)和發酵后的安化黑茶(金花黑茶)，于100 mL沸水中浸泡10 min。殘渣再加沸水浸泡2次，合并濾液，濃縮至50 mL，用去離子水定容至100 mL，備用。在熒光池中加入400 μL CyQ-Cys溶液和100 μL 黑茶備用液，測其熒光發射光譜，激發光和發射光的狹縫寬度均為10 nm，電壓為 500 V，激發波長為460 nm，平行測試3次。

3 結果與討論

3.1 探針CyQ-Cys的構建及光譜表征

根據生物硫醇可與金屬離子絡合的特性，利用巰基與鹵素之間的親核取代反應和重排機制[25,26]，將化合物CyQ與Cys結合而構建探針CyQ-Cys。如圖3A所示，隨著Cys濃度的增加，化合物CyQ的熒光強度逐漸減弱，當Cys濃度為110 μmol/L時，熒光猝滅最明顯，因此后續實驗均采用此濃度。此外，研究了探針CyQ-Cys與Fe3+作用前后的紫外-可見吸收光譜及熒光發射光譜的變化情況。如圖3B所示，探針CyQ-Cys在460 nm處產生強的吸收峰，與Fe3+作用后，吸收峰的強度明顯減弱。圖3C表明，探針CyQ-Cys與Fe3+作用后，在近紅外區662 nm處的熒光信號顯著增強。光譜信號的變化說明，探針CyQ-Cys與Fe3+作用前后展現了熒光的“關-開”過程，有利于Fe3+的熒光檢測。

圖3 (A) 化合物CyQ與Cys作用前后的熒光發射光譜; (B) 探針CyQ-Cys與Fe3+作用前后的紫外-可見吸收光譜和(C)熒光發射光譜Fig.3 (A) Fluorescent emission spectra of CyQ before and after addition of Cys; (B) UV-vis absorption spectra and (C) fluorescent emission spectra of CyQ-Cys before and after addition of Fe3+

3.2 pH值的影響

考慮到Cys的等電點為5.05，CyQ-Cys作為Fe3+的熒光探針主要基于Fe3+與羧基、氨基和巰基之間的配位作用，而溶液的pH值會改變氨基的存在方式，進而改變CyQ與Cys的結合方式，從而影響CyQ-Cys的熒光響應。探針CyQ-Cys與Fe3+作用前后在662 nm 處的熒光強度與pH值關系曲線見圖4。如圖4A所示，在pH=7時，探針CyQ-Cys的熒光信號較弱，但Fe3+的加入顯著提高了體系的熒光強度。在pH 6.0～6.5范圍內，Cys并不能有效淬滅化合物CyQ的熒光強度，盡管加入Fe3+后的熒光信號增強，但熒光強度的變化可以忽略不計；而pH=8.0時，探針Cys促使CyQ的熒光強度顯著減弱，但加入Fe3+并不能恢復體系的熒光信號。可能是在酸性條件下，Cys分子中的氨基帶正電荷，難以競爭取代巰基，導致熒光信號不易淬滅，而Fe3+會在堿性條件下形成Fe(OH)3，從而減少了其與探針CyQ-Cys的配位，阻礙了體系熒光信號的恢復。由圖4B可知，探針CyQ-Cys的熒光信號在30 min內保持穩定，且與Fe3+作用后的熒光信號也保持恒定，說明探針CyQ-Cys與Fe3+作用前后均具有較強的穩定性。因此，本方法可在pH=7的條件下檢測Fe3+含量。

圖4 (A) pH值對探針CyQ-Cys與Fe3+作用前后的熒光強度(λem=662 nm)的影響; (B) 探針CyQ-Cys與Fe3+作用前后的穩定性Fig.4 (A) Effect of pH value on fluorescent intensity of CyQ-Cys before and after treatment with Fe3+;(B) Stability of CyQ-Cys before and after treatment with Fe3+ (λem=662 nm)

3.3 動力學過程

室溫下，固定pH=7，在探針CyQ-Cys的熒光信號趨于平穩后加入Fe3+，進一步考察了探針CyQ-Cys與Fe3+反應過程中熒光發射光譜的變化。如圖5所示，在30～60 s內，探針CyQ-Cys在662 nm處的熒光強度迅速增強，大約20 s后熒光強度達到最大并基本保持穩定，說明探針CyQ-Cys與Fe3+存在良好的絡合作用且反應迅速，可用于對Fe3+的快速檢測。

圖5 探針CyQ-Cys與Fe3+作用的動力學曲線Fig.5 Kinetic curve of CyQ-Cys upon incubation with Fe3+ (λem=662 nm)

3.4 離子選擇性

為了驗證探針CyQ-Cys對Fe3+的選擇性，選擇Fe3+及其它常見離子為識別對象，考察它們與CyQ-Cys作用前后熒光強度的變化。圖6A表明，Al3+、 Fe2+對CyQ-Cys熒光強度的增強可以忽略不計，Cu2+、 Zn2+、 Hg2+、 Pb2+、 Mn2+、 Ag+、 Co2+等離子使體系的熒光強度進一步減弱，而Fe3+可顯著提高檢測體系的熒光強度，表明探針CyQ-Cys用于Fe3+檢測具有較好的特異性響應。尤其是Fe3+與其它金屬離子共存時，如圖6B所示，探針CyQ-Cys對Fe3+仍顯示較強的抗干擾能力，說明探針CyQ-Cys是選擇性良好的熒光增強型Fe3+近紅外熒光探針。

圖6 (A) 探針CyQ-Cys與不同離子作用前后的熒光發射光譜，(B) 在干擾離子共存下，探針CyQ-Cys與Fe3+作用后的熒光強度變化。F0和F分別表示探針加入金屬離子前后在662 nm處的熒光強度，其中，1～10分別代表Cu2+、 Zn2+、 Hg2+、 Pb2+、 Mn2+、 Ag+、 Co2+、 Al3+、 Fe2+和Fe3+Fig.6 (A) Fluorescent emission spectra of CyQ-Cys upon incubation with different ions; (B) Changes of fluorescent intensity of CyQ-Cys before and after addition of Fe3+. Inset, the number of 1 to 10 on behalf of Cu2+, Zn2+, Hg2+, Pb2+, Mn2+, Ag+, Co2+, Al3+, Fe2+ and Fe3+ respectively. F0 and F are fluorescent intensity of CyQ-Cys in the absence and presence of different metal ions, respectively (λem=662 nm)

3.5 Fe3+的檢測

為了考察不同濃度Fe3+存在時體系熒光強度的變化，在此檢測體系中加入不同濃度的Fe3+，測定相應的熒光發射光譜如圖7所示。探針CyQ-Cys在662 nm處具有較弱的熒光信號，但隨著Fe3+濃度的增加，其熒光強度逐漸增強，且Fe3+在40 ～300 μmol/L的濃度范圍內與探針CyQ-Cys的熒光強度變化呈良好的線性關系，線性方程為y= 1.0619x+ 0.01355 (R2=0.9910)，檢出限為10.4 μmol/L (S/N=3)。

圖7 (A) 探針CyQ-Cys與不同濃度的Fe3+離子作用前后的熒光發射光譜；(B) 探針CyQ-Cys的熒光強度變化與Fe3+濃度的線性關系，F0和F分別表示探針CyQ-Cys加入Fe3+前后在662 nm處的熒光強度Fig.7 (A) Fluorescent emission spectra of CyQ-Cys in the presence of different concentrations of Fe3+; (B) Plot of F/F0 versus Fe3+ concentration. F0 and F are fluorescent intensity of CyQ-Cys in the absence and presence of Fe3+, respectively (λem=662 nm)

3.6 識別機理研究

圖8 (A) 化合物CyQ與谷胱甘肽、半胱氨酸及N-乙酰基半胱氨酸反應的熒光發射光譜； (B) 探針CyQ-Cys與Fe3+的Job曲線Fig.8 (A) Fluorescent emission spectra of CyQ upon incubation of Cys, N-acetylcysteine (NAC), and glutathione (GSH); (B) Plot of F/F0 versus concentration ratio of Fe3+ to CyQ-Cys. F0 and F are the fluorescent intensity of CyQ-Cys in the absence and presence of different Fe3+, respectively (λem=662 nm)

3.7 實際樣品中Fe3+檢測

以益陽資江河水為測試對象，進一步評價本方法檢測Fe3+的實用性，結果如表1所示，本方法檢測環境水樣中Fe3+的加標回收率和標準偏差符合檢測要求，具有良好的應用前景。尤其是Fe2+極易被氧化為Fe3+，因此，本方法可應用于實際水樣中鐵含量的檢測。

表1 資江河水中Fe3+的加標實驗結果

Table 1 Determination of Fe3+in Zijiang river water samples

序號No.加入值Added(μmol/L)測得值Found(μmol/L)回收率Recovery(%, n=3)相對標準偏差RSD(%, n=3)10.00.0—250.050.8101.61.33100.098.598. 62.04150.0151.2100.81.7

3.8 黑茶抗氧化活性檢測

參考鐵離子還原法[23]，以茶葉水提物為測試對象，進一步考察本方法檢測黑茶抗氧化活性的可行性，結果如表2所示。結果表明，檢測體系的熒光強度隨水提物體積分數的增大而下降，熒光強度越弱，表明更多的Fe3+被還原為Fe2+，即體系的還原性越強。因此黑茶具有較強的抗氧化活性，且金花黑茶的抗氧化活性高于毛茶。

表2 毛茶和金花黑茶的抗氧化活性

Table 2 Antioxidant capacity of raw tea and dark tea

序號No.水提物體積分數Volume fraction ofaqueous extract(%)毛茶Raw tea(F/F0)黑茶 Dark tea(F/F0)相對標準偏差RSD(%, n=3)110.00.910.842.2230.00.850.722.8350.00.780.661.7

4 結 論

合成了喹啉基花菁類染料CyQ，利用其與Cys的鹵素-巰基親核取代反應導致CyQ的熒光信號淬滅，構建了一種近紅外熒光探針CyQ-Cys。根據Fe3+誘導CyQ-Cys體系的熒光強度明顯恢復，建立了一種Cys介導的“關-開”型近紅外熒光探針檢測Fe3+的方法。本方法具有合成簡單、響應速率快(< 30 s)、選擇性高及近紅外發射等優勢，探針響應不受其它金屬離子的干擾，并應用于Fe3+快速檢測以及黑茶的抗氧化活性檢測。