藤黃酸納米脂質體的制備與優化

武恒儀 潘婭 楊佳

摘 ? ? ?要：以磷脂酰膽堿（phosphatidylcholine，PC）作為主要膜材，對三種藤黃酸納米脂質體制備方法進行了篩選;對磷脂濃度、磷膽比、藥脂比、水合介質體積等影響因素實施了篩選，采用正交設計實驗對工藝重現性進行了優化考察。結果表明：薄膜分散-超聲法為優選方法。優選工藝處方為：磷脂濃度10 mg/mL，磷膽比為3∶1，藥脂比為1∶10，水相體積20 mL，此工藝制備的藤黃酸的納米脂質體，粒徑優，包裹率高，質量穩定，可作為藤黃酸的一種新型納米制劑。

關 ?鍵 ?詞：藤黃酸;脂質體;薄膜分散超聲法;正交試驗設計

中圖分類號：R94 ? ? ? ? ? ?文獻標識碼： A ? ? ? 文章編號： 1671-0460（2019）12-2785-04

Abstract： The phosphatidylcholine （PC） was used as the main membrane forming material and three preparation methods of liposomes were optimized to encapsulate gambogic acid （GA）， the active substance of a traditional Chinese medicine. Parameters， such as concentration of PC， amount of cholesterol （Chol）， ratio of GA to membrane material and volume of aqueous phase were optimized by orthogonal experimental design and reproducibility analysis. The results indicated that the film rehydration was the suitable preparation method. When the concentration of PC was 10 mg/mL， PC∶Chol = 3∶1， the ratio of drug to liquid was 1∶10 and the volume of hydration phase was 20 mL， the highest encapsulation efficiency of GA was obtained. Therefore， the GA liposome can be applied as a novel nanomedicine with promising encapsulation efficiency， enhanced stability and better properties.

Key words： Gambogic acid; ?Liposome; Ultrasound film rehydration; Orthogonal design

現代研究證明，藤黃中所含有的以藤黃酸（gambogic acid），新藤黃酸（neo-gambogic acid）等為代表的酸性黃酮類化合物被認為是藤黃的主要活性物質[1]，具有廣譜抗癌作用，對多種腫瘤細胞包括宮頸癌，膽管癌，肝癌，乳腺癌，胃癌，膀胱癌，膠質母細胞瘤和骨肉瘤細胞等有顯著的抑殺作用[2-4]。研究還表明，藤黃酸、新藤黃酸活性物質的抗腫瘤機制與常用化療藥物相比有獨特的優勢，不僅可靶向殺死腫瘤細胞而不傷害正常細胞，并且對造血系統和免疫功能無明顯影響[5，6]。然而由于藤黃酸的不穩定性與水溶性差，傳統劑型諸如注射液或硼酸水溶液的血漿半衰期極短，這使得其抗癌作用與生物利用度受到了極大的限制。脂質體作為一種新型納米載藥系統，具有包裹溶質并選擇性釋放內容物的能力，與抗腫瘤藥效團相搭載，可以減少傳統化療的耐藥性并增強靶向性，避免體內免疫系統的排異清理，增強作用時效[7，8]。開發藤黃酸納米脂質體制劑，克服藤黃酸的缺點，改善藤黃酸活性物質的穩定性，具有切實的實際意義。

本文以磷脂酰膽堿（phosphatidylcholine，PC）作為主要膜材，對不同藤黃酸納米脂質體制備方法進行篩選;對藥脂比、水合介質體積以及膽固醇與卵磷脂的質量比等進行單因素和正交設計實驗，并對優選的工藝進行重現性考察，以探索藤黃酸納米脂質體制備方法。

1 ?實驗部分

1.1 ?儀器

RE-52AA旋轉蒸發器（上海亞榮生化儀器廠）;DF-101S 集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（鞏義市予華儀器有限責任公司）;FA2004B電子天平（上海佑科儀器儀表有限公司）;PHS-25 pH計（上海盛磁儀器）;UV-2450紫外分光光度計（島津企業管理（中國）有限公司）;安捷倫1260Infinity II 液相色譜系統;ZS Nano S馬爾文粒度儀（英國Malvern儀器有限公司）;KQ3200B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 ?材料

大豆卵磷脂（上海源聚生物科技有限公司），膽固醇（上海伯奧生物科技有限公司），藤黃酸標準品（中國食品藥品檢定研究所，純度97%）。藤黃酸提取物（自制），大豆卵磷脂（上海源聚生物科技有限公司），PEG 4000，膽固醇（上海伯奧生物科技有限公司），磷酸二氫鈉（分析純），磷酸氫二鈉（分析純）（廣州化學試劑廠），甲醇（分析純）（廣州市東紅實業發展有限公司），三氯甲烷（分析純）（廣州化學試劑廠）。

2 ?實驗方法

2.1 ?薄膜分散-超聲法制備藤黃酸脂質體

精確稱量磷脂酰膽堿（PC）60 mg，膽固醇（Chol）30 mg和藤黃酸提取物（GA）4 mg，置于50 mL燒杯中，滴加 15.0 mL 三氯甲烷溶解，利用旋轉蒸發儀以30 ℃、0.01 MPa旋蒸成膜，速度適中，待溶劑除去后，增大真空度除去痕量氯仿。接著向燒瓶中加入處方量的磷酸緩沖鹽溶液（PBS，pH=7.4）與少量玻璃珠（粒徑2 mm），旋轉水合5 min。之后超聲10 min，即得藤黃酸脂質體。

2.2 ?復乳法制備藤黃酸脂質體

精確稱量磷脂酰膽堿（PC）60 mg，膽固醇（Chol）30 mg和藤黃酸（GA）4 mg，乳化劑選擇單硬脂酸甘油酯10 mg，15 mL三氯甲烷溶解，得到油相;將5 mL PBS溶液加入油相中，2 000 r/min下均質20 min，得到W/O型初乳。初乳旋蒸除去有機溶劑，再加入10 mL PBS水相溶液，相同條件均質15 min即得藤黃酸脂質體。

2.3 ?注入法制備藤黃酸脂質體

精確稱量磷脂酰膽堿（PC）60 mg，膽固醇（Cho）30 mg和藤黃酸（GA）4 mg，10 mL熱乙醇溶解。將油相通過針頭緩慢加入100 mL PBS 緩沖液中，一邊加入一邊在55 ℃水浴下慢速攪拌10 min，2 h充分水合，2 000 r/min均質15 min即得藤黃酸脂質體。

2.4 ?以粒徑為指標單因素分析

對薄膜分散法制備的藤黃酸納米脂質體處方進行單因素考察，分析磷脂濃度、藤黃酸與磷脂質量比（藥脂比）、磷脂與膽固醇質量之比（磷膽比）、水相體積對藤黃酸納米脂質體平均粒徑分布的影響。

2.5 ?脂質體包封率的測定方法

分別量取2 mL藤黃酸脂質體原液置于兩個離心管中，向其中一組加入2 mL甲醇破乳，離心（200 000 g，30 min）后取1 mL上清液在藤黃酸最大吸收波長（360nm）減去空白（50%甲醇溶液）測吸光度，根據標準曲線計算得游離藤黃酸濃度C游。另一組離心棄去上清液，補加4mL甲醇破乳，同法測得包封藤黃酸濃度C包。則脂質體包載的藤黃酸質量與相應包封率可以計算得到。

2.6 ?以包封率為指標的正交試驗

本文采用正交實驗對藤黃酸納米脂質各處方因素加以優化。在對比了磷脂濃度、藥脂比、磷膽比、水相體積的基礎上，根據實驗結果，做 l12（34）的正交試驗設計方案，固定搭載藥物為4 mg，水平及因素條件如表1。

2.7 ?工藝重現性考察

對正交實驗得出制備藤黃酸納米脂質體的最佳處方組合的穩定性和可行性進行驗證，按此工藝連續制備3組藤黃酸納米脂質體，對其包封率和平均粒徑分布進行檢測，并計算RSD值，以此來考察優化的制備工藝的重現性。

2.8 ?穩定性考察

2.8.1 ?累積釋放率

預先將透析袋、固定夾、攪拌子煮沸處理，取5 mL藤黃酸脂質體置于截留分子量為14 000 Da的透析袋中，用蒸餾水沖洗干凈。將透析袋置于100 mL的蒸餾水中，其中磁力攪拌器的轉速設為 300 r/min，溫度為37 ℃。每隔1 h取透析液1 mL，每次取液后補充1 mL蒸餾水，共測六組。根據紫外法的測定濃度變化即得釋放率。累積釋放率（%）公式為：

2.8.2 ?長期穩定性

按上文優化方法制備脂質體樣品，測定包封率，之后分成3組置于A室溫，B 50 oC ，C 4 oC于0、24、48、72、96 h測定其包封率，取各采樣點包封率平均值繪制包封率變化曲線。

3 ?實驗結果

3.1 ?制備工藝篩選結果

分別采用薄膜分散法，復乳法，乙醇注入法制備藤黃酸納米脂質體后，選用超速離心法測定其包封率，并用馬爾文納米粒度分析儀動態光散射法（DLS）測定其平均粒徑分布（圖1），相關結果如下。

由圖1與表2中結果可得，當藤黃酸納米脂質的處方量一定時，薄膜分散法制備的脂質體包封率最高，平均粒徑較小;乙醇注入法制備的脂質體，包封率也最小，平均粒徑最大;因而，實驗采用包封率高，工藝成熟，操作簡單的薄膜分散法來制備藤黃酸納米脂質體。

3.2 ?單因素粒徑影響分析

對薄膜分散法制備的藤黃酸納米脂質體處方進行單因素粒徑影響分析，各因素設計為：磷脂濃度6、8、10、12、12 mg/mL;藥脂比（藥物：磷脂質量）1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30;膽磷比（膽固醇/磷脂質量）1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5;水相體積10l、15、20、25、30 mL;分組考察時，其余條件固定不變。同法測定平均粒徑分布（表3）。

依順序篩選磷脂濃度，藥脂比，膽磷比和水相體積對脂質體平均粒徑的影響，從各組分數據來看，藥脂比對脂質體的質量影響最大，當其最優值確定為1∶15時，所得平均粒徑最小。類似的，可以確定膽磷比和水相體積的最優值分別為1∶4和20 mL。

3.3 ?正交試驗結果分析

在對比了磷脂濃度、藥脂比、磷膽比、水相體積的基礎上，根據實驗結果，做 log34的正交試驗設計方案，固定搭載藥物為4 mg（表4-5）。

直觀分析結果顯示，各因素影響程度為C>A>B>D，其中，C即藥脂比的因素對包封率影響最大，B磷脂濃度次之，C膽磷比與D水相體積對包封率影響較小。但是F檢驗不具備顯著性。究其原因，四項因子已初選一遍，其差異性明顯降低。綜合以上結果，薄膜分散-超聲法的最優處方工藝為A3B2C1D3，即磷脂濃度10 mg/mL，膽磷比為1∶3，藥脂比為1∶10，水相體積20 mL。

3.4 ?工藝重現性考察

按照制備藤黃酸納米脂質體的最佳處方組合重復制備3組藤黃酸納米脂質體，對其包封率和平均粒徑分布進行檢測，并計算RSD值，考察優化的制備工藝的重現性。

表6所示，三批藤黃酸脂質微泡的包封率均大于80%，符合要求，并且包封率和平均粒徑的相對標準偏差較小。說明優化的制備工藝重現性較好，穩定可靠。

3.5 ?穩定性考察

由表7與圖2所示，累計釋放率和長期穩定性表明脂質體在37 oC的環境下6 h的滲透率達到6.87% ，而冷藏長期儲存下的泄露程度僅為2.67%，說明制劑具有較好的穩定性。而高溫和室溫的穩定性較差。

4 ?討論

本章以包封率和平均粒徑分布為主要評價指標，對藤黃酸脂質的制備工藝進行了篩選，并通過單因素考察和正交設計實驗對其處方進行優化。

脂質體的結構主要是由制備方法所決定的。薄膜分散法制備多層脂質體，溶劑注入法制備小單層脂質體，復乳法制備多囊脂質體等。通過改變制備工藝來得到不同結構的脂質體制劑，從而起到不同的目的。

粒徑作為影響納米載藥系統藥動學與藥物靶向性的主要因素，決定著脂質體在體內的分布與被動靶向性作用。Desai[9]等報道，納米脂質體的透膜性隨其粒徑的增加而減少，粒徑影響著脂質體在細胞水平上的多種作用機制，即吸附、交換、內吞、融合等。具有藥用價值的脂質體粒徑不能過大[10]。

藤黃酸具有親脂性，lgP =7.6[11]，在水中溶解度很小，僅為2 mg/mL。本課題主要選用薄膜分散法作為制備工藝優化的方法，所制得的藤黃酸脂質體制劑平均粒徑為150～300 nm，粒徑分布良好，且包封率高，長期性質穩定。因此，本文對藤黃酸納米劑型的開發與未來體內靶向性研究具有一定意義。

參考文獻：

[1]張文君，寇永強，朱鵬舉. 藤黃有效成分-藤黃酸的研究進展[J]. 中國藥劑 學雜志. 2013，06：121-129.

[2]陳葆仁.藤黃抗癌成分的研究Ⅰ、藤黃酸的分離和結構的鑒定[J].南昌大學學報：醫學版，1980（2）.

[3]Yang Y， Yang L， You Q D， et al. Differential apoptotic induction of gambogic acid， a novel anticancer natural product， on hepatoma cells and normal hepatocytes[J]. Cancer Letters， 2007， 256（2）：259.

[4]Doddapaneni R， Patel K， Owaid I H， et al. Tumor neovasculature-targeted cationic PEGylated liposomes of gambogic acid for the treatment of triple-negative breast cancer[J]. Drug Delivery， 2015， 23（4）：1-10.

[5]王麗莉.藤黃和雙籽藤黃化學成分及抗腫瘤活性研究[D].沈陽藥科大學，2008.

[6]白皎皎， 陳新棉， 曾代文， 等. 藤黃酸抗腫瘤作用機制及其納米制劑的研究進展[J]. 華西藥學雜志， 2018 （6）： 24.

[7]孫慶雪，邵偉，黃桂華.脂質體制備方法的選擇[J].中成藥， 2010， 32 （8）： 1397-1401.

[8]王佰寧. 藤黃中藤黃酸和新藤黃酸的提取分離及藥理毒理研究[D]. 吉林農業大學， 2015.

[9]Desai MP， Labhasetwar V， Amidon GL， et al. Gastrointestinal uptake of biodegradable microparticles： effect of particle size[J]. Pharm Res， 1996， 13： 1838?1845.

[10]楊艷芳， 謝向陽， 楊陽，等. 粒徑與表面電荷影響脂質體體內藥物靶向遞送的研究進展[J]. 藥學學報， 2013， 48（11）：1644-1650.66.

[11]Doddapaneni R， Patel K， Owaid I H， et al. Tumor neovasculature-targeted cationic PEGylated liposomes of gambogic acid for the treatment of triple-negative breast cancer[J]. Drug Delivery， 2015， 23（4）：1-10.