let-7a荷載AS1411與lipidoid共修飾陽離子脂質復合物的制備

仲婷婷 李言 高彬彬

摘 ? ? ?要：構建了let-7a荷載AS1411與lipidoid共修飾陽離子脂質復合物，并對其理化性質進行考察。合成荷正電荷類脂質材料N，N-二油酰三羥甲基氨基甲烷（2-氨基乙基）胺（Lipidoid），然后結合乙醇注入法與靜電吸附法，制備荷載let-7a的AS1411與lipidoid共修飾陽離子脂質復合物（let-7a/AS1411-Lipoplex），評價其制劑學性質。通過薄層色譜法（TLC）、核磁共振法（1H-NMR）、傅里葉轉變紅外法（FT-IR）和液質聯用儀（LC-MS）法驗證了Lipidoid的結構。所制得let-7a/AS1411-Lipoplex大小規整，平均粒徑為70 nm，Zeta電位為30 mV，AS1411-Lipoplex明顯改善let-7a在血清中降解。成功構建可高效荷載let-7a的適配體（AS1411）與lipidoid共修飾的脂質復合物，為后續研究打下基礎。

關 ?鍵 ?詞：let-7a;適配體;類脂多胺;陽離子脂質復合物

中圖分類號：TQ 350.35 ? ? ? 文獻標識碼： A ? ? ?文章編號： 1671-0460（2019）12-2817-04

Abstract：To prepare and evaluate let-7a-loaded aptamer and lipidoid co-modified cationic lipoplex （let-7a-As- lipoplex），a novel cationic lipid like material， N， N-dioleoyltris （2-aminoethyl） amine （Lipidoid） was obtained through the substitution and amidation reaction method. After verifying the structure of Lipidoid， let-7a-loaded AS1411 and lipidoid co-modified cationic lipoplexs（let-7a-As-lipoplex） were prepared through the ethanol injection and electrostatic adsorption technique. The physicochemical properties of lipoplexs， such as particle size， Zeta potential and encapsulation efficiency of let-7a were investigated. Finally， the in vitro stabilities of let-7a were measured. TLC， 1H-NMR，FT-IR and LC-MS assay were used to confirm the structure of Lipidoid. A novel cationic lipoplex modified with Lipidoid and AS1411 was developed which have spherical structure with mean size of 70 nm and Zeta- potential of 30 mV. In vitro anti-RNase test showed that co-modified cationic lipoplexs improved the stability of let-7a in serum. The preparation method of let-7a-loaded AS1411 and lipidoid co-modified cationic lipoplexs was established.

Key words： Let-7a; AS1411; Lipidoid; Cationic lipoplexs

let-7a作為早期發現的人類miRNA，引起大家廣泛關注。研究表明，let-7a在腫瘤，尤其在肺癌呈下調的趨勢，并與其進程負相關。let-7a與肺癌患者的預后也有密切關系，能夠調節肺癌細胞的增殖、遷移和侵襲[1-5]。上調let-7a，有望達到效發揮肺癌的治療[6]。但是， naked-miRNA極易被血清中的Nulease降解，與細胞膜發生靜電排斥，導致細胞攝取率低，故臨床應用中具有局限性。關于miRNA類的非病毒類載體的研究備受矚目，成為有效進行基因治療的關鍵手段[7， 8]。陽離子脂質復合物（或脂質體）具有較高的基因包封率、細胞攝取和可生物降解等特點，但是，其細胞毒性又成為屏障。所以，關于腫瘤靶向性荷正電脂質載體的研究日益受到研究者的興趣[9]。

本研究首先合成新型陽離子脂質材料N，N-二油酰三羥甲基氨基甲烷（2-氨基乙基）胺（N，N-dioleoyltris （2-aminoethyl） amine，Lipidoid），然后進行腫瘤靶向性AS1411修飾[10]，探究其作為miRNA的載體的可行性，以便為后續研究提供依據。

1 ?實驗部分

1.1 ?實驗材料

三氟乙醇、三-（2-氨乙基）胺、（阿拉丁試劑有限公司）;Oleoyl chloride（日本和光純藥工業株式會社）;β-丙內酯（將來實業有限公司）;DMAEMA（薩恩化學技術有限公司）;膽固醇（國藥集團化學試劑有限公司）;大豆磷脂S100（Lipoid）;羧基熒光素標記的let-7a（FAM-let-7a，正義鏈：5-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3，反義鏈5-ACGUGACACGUUC GGAGAATT-3，上海吉瑪有限公司）。

1.2 ?實驗儀器

旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠），中壓玻璃層析柱（聯華玻璃儀器廠），超導核磁共振譜儀（美國瓦里安公司），水平電泳槽（美國Bio-Rad公司），凝膠成像系統（英國syngene公司），激光粒度儀（美國PSS公司），透射電鏡（美國FEI公司）。

2 ?實驗方法

2.1 ?Lipidoid的合成

取三氟乙醇（7 mL）和油酰氯（6.2 mL），在圓底燒瓶中混合，再加入催化劑三乙胺（2.6 mL），在恒溫條件下回流過夜（85 ℃）。反應結束，將上述燒瓶中的液體轉移到分液漏斗萃取，萃取劑是水和乙酸乙酯。通過旋轉蒸發去掉有機相中過量的乙酸乙酯和三氟乙醇，獲得粗產物。以石油醚：乙酸乙酯（20∶1）為展開劑，薄層色譜分析。將上述展開劑滴加至浸泡于石油醚的硅膠柱，梯度洗脫分離并收集洗脫液。收集過程中，用薄層色譜法來確定產物，旋轉蒸發得到類脂的中間體。

取乙醇（20 mL）和三-（2-氨乙基）胺（1.1 g），放在適宜圓底燒瓶中混勻，再加入中間體（4.0 g），燒瓶抽真空后充入氮氣，在恒溫攪拌（85 ℃，24 h）。以氯仿：甲醇（10∶1）為展開劑，硅膠薄層色譜分析。取樣品溶液緩慢滴加到氯仿浸泡平衡的硅膠柱，梯度洗脫，收集洗脫液。合并含Lipidoid收集瓶，揮發洗脫液，即得[11]。通過薄層色譜法、核磁共振法和傅里葉轉變紅外法表征中間體和終產物的化學結構。

2.2 ?荷載let-7a的脂質復合物的制備與表征

2.2.1 ?AS1411修飾荷載let-7a的脂質復合物的制備（let-7a-As-lipoplex）

空白脂質復合物通過乙醇注入法制備。分別稱取S-100大豆磷脂（15 mg），膽固醇（8 mg），Lipidoid（11 mg），超聲溶解于無水乙醇（1 mL），緩慢滴入恒溫蒸餾水（37 ℃，10 mL），揮發乙醇，得脂質復合物（lipoplexs）。按照已優化的N/P比（25：1），將let-7a與lipoplexs混勻，孵育（37 ℃，30 min），得荷載let-7a的脂質復合物（let-7a-lipoplex）。將適配體（FITC-AS1411）與let-7a-lipoplex共孵育（37 ℃，30 min），即得適配體修飾脂質復合物（let-7a-As-lipoplex）。

2.2.2 ?let-7a-As-lipoplex的評價

檢測lipoplex的粒徑及Zeta電位，透射電鏡（TEM）觀察其大小和形態。

2.2.3 ?抗RNase A降解實驗

將let-7a-As-lipoplex與等量naked-let-7a溶液分別與等體積的RNAse A溶液（10 mg/mL）混合均勻，放置預定時間（0 min～5 h）后加EDTA溶液使酶失活停止降解，加入肝素溶液（0.7 mg/ml）置換出游離的let-7a，渦旋，孵育（20 min）。瓊脂糖電泳法考查let-7a-As-lipoplex的穩定性。

2.2.4 ?血清穩定性實驗

分別精密量取naked let-7a和Apt-NLs- let-7a 100 μL，與血清孵育一定時間，瓊脂糖電泳法考察let-7a-As-lipoplex抗血清降解能力。

3 ?實驗結果

3.1 ?中間體與Lipidoid的結構表征

3.1.1 ?薄層色譜法

中間體和Lipidoid的薄層色譜分離結果如圖1所示。可見，中間體油酸三氟乙酯和Lipidoid的斑點，且周圍未見清晰的雜質斑點。

3.1.2 ?核磁共振法

在油酸三氟乙酯氫譜圖中，于4.5 ppm處可見酯鍵的吸收峰，驗證產物的生成。在終產物Lipidoid圖譜中，中間體酯鍵的位移峰消失（4.5 ppm），出現新的位移峰，與生成的產物中酰胺鍵上的H位移相同，根據與酰胺鍵中N相連的碳上H和油酸鏈中不飽和C上H的峰面積推算出產物是含2個油酸鏈的Lipidoid，推測產物的結構式與Lipidoid一致，證實Lipidoid的生成。

3.1.3 ?紅外

自中間體的紅外光譜圖結果發現，因為C=O的伸縮振動在1 745和3 447 cm-1處有兩個峰，因為C-O的伸縮振動在1 148和1 283 cm-1處出現了峰，驗證了中間體的合成。終產物的紅外結果圖顯示，酰胺鍵中C=O的伸縮振動峰出現在1 648 cm-1，N-H的彎曲振動在1 545 cm-1處，3 300 cm-1處也有N-H的伸縮振動峰，驗證了Lipidoid的合成。

3.1.4 ?Lipidoid的MS圖譜

MS圖譜結果表明，化合物分子量是675.4，與Lipidoid的分子量一致，驗證Lipidoid的合成。

3.2 ?let-7a-As-lipoplex的粒徑、電位和形態表征

陽離子脂質體的的粒徑和電位，測定結果見表1。

let-7a荷載脂質復合物（let-7a-lipoplex）的粒徑與空白脂質復合物（lipoplex）比較，具有一定的增加趨勢，Zeta電位變化不大。經適配體修飾后的let-7a-lipoplex的粒徑呈明顯的增加，其機制有待于進一步研究。

TEM結果圖表明（圖2-A），let-7a-lipoplex的微粒大小分布均勻，形態圓整[12]。空白脂質復合物的穩定性實驗結果（圖2-B），在30天內，其粒徑變化不大。故后續實驗中采用制備lipoplex保存，然后考察前實施let-7a的荷載與AS1411修飾的方法。

3.3 ?Lipoplex對let-7a保護能力的考察

結果表明（圖3-A），0.6 mg/mL的肝素溶液能夠將let-7a-As-lipoplex中的let-7a置換。圖3-B顯示，naked-let-7a在RNAse酶作用1 h后條帶已消失，而let-7a-As-lipoplex中的let-7a在2 h到12 h間依然可以看見清晰的條帶，與RNAse酶混合24 h后仍然有80%左右（圖3-C）。證明本方法制備的let-7a-As-lipoplex能保護let-7a不受酶的作用。

3.4 ?血清穩定性實驗

如圖4所示，裸let-7a在血清中孵育1 h后條帶就已消失，let-7a-As-lipoplex中的let-7a在24 h后仍然有清晰的條帶，說明載體能遞送let-7a，不受血清中核酸酶的降解。

4 ?結論

通過自制新型陽離子材料Lipidoid，乙醇注入法制得陽離子脂質復合物lipoplex，又在其表面連接了具有腫瘤靶向特點的適配體（AS1411）。所制備的Apt-NLs形狀圓整、粒徑大小均一，荷載let-7a后其粒徑約為100 nm，荷正電荷。體外抗RNA酶降解實驗和血清穩定性實驗結果都表明let-7a-As-lipoplex能夠很好的保護let-7a的穩定性，該項研究為let-7a相關的細胞學評價與體內腫瘤研究提供了實驗依據。

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