黑曲霉檸檬酸生產菌常用的保藏方法

劉夢涵 葉海強 李黎明

摘 ? ? ?要：菌種保藏一般出于兩種情況，一是為了隨時供生產應用，要求菌種經常處于活化狀態，通常保存的是斜面菌種;另一種是為了長期保存，要求菌種處于休眠狀態，一般采用沙土管、石蠟封存存發和真空冷凍干燥法。介紹了黑曲霉生產菌常用的保藏方法即斜面低溫保藏法和沙土管保藏方法。該方法制作簡單，操作方便，菌種活力高。

關 ?鍵 ?詞：黑曲霉孢子;保藏;沙土管

中圖分類號：TQ 016.1 ? ? ? 文獻標識碼： A ? ? ? 文章編號： 1671-0460（2019）12-2804-04

Abstract： The preservation of bacteria species is generally based on two conditions. One is that the bacteria species are in activated state for production and application at any time; The other is that the bacteria species are in dormant state for long-term preservation. Generally， sand pipe， paraffin wax storage and vacuum freeze drying method are adopted for long-term preservation. In this paper， the common storage methods of aspergillus nigra producing bacteria were introduced in detail， namely inclined plane low temperature storage method and sand pipe storage method. The methods are simple， easy to operate and can maintain high bacterial activity.

Key words： Aspergillus niger spores; Preservation; Sand tube

受外界環境的影響，微生物經常發生小幾率的變異，這種變異會導致菌種生產性狀的劣化或自身的死亡。要使生產菌株在反復使用過程中，保持高產菌株的特征，在做好菌種選育的同時，菌種保藏工作必須同步進行。

在生產和培養過程中，菌種會衰退，純度會下降，為了提高菌種的存活率，減少菌種的變異，盡量使菌種保持原有的優良生產性狀菌種，為此必須創造一個合適的休眠環境條件，即干燥、低溫、缺氧和缺乏養料等條件，使菌種代謝活動處于最低的狀態，使菌種保持活力，但又不至于死亡，從而達到保藏的目的。

菌種保藏應根據保藏要求，即短期、中期、長期保藏，以及黑曲霉檸檬酸生產菌的特點選用合適的方法。鑒于黑曲霉能生成大量的分生孢子，一般選用保藏孢子的方法進行保藏。生產上目前常用的保藏方法主要有斜面保藏法、沙土管保藏法、真空冷凍干燥保藏法[1]。

斜面保藏法是生產中普遍采用的一種保藏方法，即菌種孢子移接于土豆汁瓊脂斜面后，于35 ℃下培養4～5 d，待長滿黑褐色孢子后，放置在4 ℃冰箱中保存，此法可保藏1～2個月。但缺點是菌株在4 ℃環境條件下，培養基又提供一定的營養條件，菌種仍有一定的代謝強度，因此在這種惡劣的條件下，菌種容易產生變異，故不宜長時間保藏菌種[2]。

沙土管保藏的原理是將孢子吸附在沙土載體上，進行干燥保藏。即以斜面健壯的分生孢子拌入處理后的無菌沙土中，放置4 ℃低溫冰箱中保存。由于沙土管兼具低溫、干燥，且隔絕空氣，保藏菌種效果較好，制作又簡單，比液體石蠟法好，因此這是生產常用的長期保藏菌種的方法，保藏時間至少2～10 a。

1 ?實驗部分

1.1 ?PDA培養基配制

1.1.1 ?土豆汁的制作方法

取新鮮土豆去皮，切成小丁。取200 g土豆丁加入1 000 mL蒸餾水煮沸，煮沸后500 W維持30 min，4層紗布過濾，然后再用蒸餾水沖洗土豆丁，冷卻后將土豆汁定容至1 000 mL。

1.1.2 ?無菌空平皿準備

事先將需要用的空平皿在恒溫鼓風干燥箱中干熱滅菌（180 ℃， 2～3 h），或用高壓蒸汽鍋滅菌20 min（0.1～0.13 MPa、121～123 ℃），無菌空平皿送入無菌室內待用。

1.1.3 ?PDA平板配制

按照2%葡萄糖，1.8%瓊脂添加量加入土豆汁中，水浴鍋內溶解，待瓊脂完全溶解后，分裝三角瓶內。將裝有培養基的三角瓶送入高壓蒸汽滅菌121 ℃×20 min。滅菌結束后取出冷卻至50 ℃左右，在潔凈、無氣流循環的臺面上倒平板，待平板內培養基冷卻凝固，放入37 ℃恒溫培養箱中空白培養48 h，檢查有無染菌后，備用。

1.1.4 ?PDA小斜面配制

按照2%葡萄糖，1.8%瓊脂添加量加入土豆汁中，水浴鍋內溶解，待瓊脂完全溶解后，分裝18×180試管中，每個試管培養基體積約4～5 mL。塞上棉賽，包扎牛皮紙后，送入高壓蒸汽滅菌121 ℃×20 min。滅菌結束后取出冷卻至50 ℃左右，在潔凈、無氣流循環的略有傾斜度的臺面上擺放斜面，待斜面培養基冷卻凝固，放入37 ℃恒溫培養箱中空白培養48 h，檢查有無染菌后，備用。

1.2 ?沙土管制備

（1）取淮河邊的沙子，80 ℃烘干，烘干后用60目篩子，篩去大顆粒的粗砂及小石子，再用80目篩子去除小顆粒沙子及細土，分裝燒杯備用。

（2）取地面下40～60 cm非耕作層不含腐植質的瘦黃土或紅土，一般從河邊取。烘干、碾碎后過篩，即先用60目篩子，篩去大顆粒土及石子，再用80目篩子去除小顆粒細土，分裝燒杯備用。

（3）將過篩后的合格的沙、土用1 N稀鹽酸，煮沸30 min，浸泡24 h，以去除其中的有機質，由于淮河邊，河沙中有機質較多，再用20%鹽酸浸泡24 h。

（4）倒去酸水，用蒸餾水浸泡，并反復沖洗至，用試紙測試pH為中性即可。注意，由于土比重較輕，容易隨倒出的水流走，所以洗泡土時，一定要待土完全沉淀后，才可輕輕的倒水。

（5）再用1 N氫氧化鈉浸泡24 h，倒去堿水，用蒸餾水水浸泡并反復沖洗至中性，可用試紙測試。

（6）浸泡后的沙、土放置與80 ℃烘箱內烘干，再用40目篩子過篩，以去掉粗顆粒，備用。

（7）按沙∶土=2∶1摻合均勻，分裝入18 mm×180 mm的小試管中，每管裝2 g左右，塞上棉塞，滅菌，烘干備用。

（8）抽樣進行無菌檢查，按照10%比例抽查沙土管。將10 mL無菌生理鹽水倒入沙土管內，充分搖勻，震蕩約5 min后，涂布細菌、PDA平板，每板涂布0.2 mL。平板置于36 ℃培養基箱中培養48 h，觀察是否有雜菌，若平板無雜菌，則沙土管合格，可以使用;若平板有雜菌，則沙土管繼續滅菌2～3次，再次抽查，直至平板培養無雜菌方為合格。

1.3 ?高產菌種選育

1.3.1 ?分離用品制備

1 mL吸管若干支（封口塞上少許棉花）、分別用牛皮紙包扎好;φ90 mm玻璃漏斗一只、塞上少許脫脂棉花，放在一只空的250 mL三角瓶上，用紗布和牛皮紙包扎好;將分散孢子用的玻璃珠約30粒裝入一只250 mL三角瓶內，配制0.85%的生理鹽水100、50 mL，塞上棉塞包扎好防水牛皮紙。以上物品送入高壓蒸汽滅菌鍋內（0.1～0.13 MPa、121～123 ℃）滅菌30 min，送入無菌室待用。

1.3.2 ?菌種分離

（1） 菌種

供試驗菌種：黑曲霉（Aspergillus niger）Co827，菌種保藏號：CICC 40347，由中糧生物化學（安徽）股份有限公司提供。

玉米粉、a-淀粉酶（耐高溫）、糖化酶等均由中糧生物化學（安徽）股份有限公司提供。

（2） 設備與儀器

恒溫水浴鍋;溫度計、攪拌器、電爐; NBS INNOVER43?搖床、1 000 mL燒杯、250 mL三角瓶。

將生產用的斜面菌種制作成一定濃度的孢子懸浮液，涂布在PDA平板上，培養24 h，在無菌凈化臺上挑選菌落凸起，大小中等，不發散的菌落轉移至小斜面上進行產孢，待斜面孢子培養成熟后進行搖瓶篩選。本次平板分離共挑選28個單菌落。

1.3.3 ?搖瓶篩選

（1） 搖瓶培養基配置

25%玉米粉調漿，按照2%比列添加α-淀粉酶，稍做幾次攪拌放在水浴鍋中，95 ℃條件下液化，用碘液檢測無淀粉反應即液化完全[3-5]。留取一定量的液化液后，其余的用濾布過濾出清液，將液化液、液化清液按照一定比例混合，分裝搖瓶40 mL/瓶，不補水。滅菌121 ℃×20 min。

（2） 搖瓶初篩

挑選的28個單菌落，利用挖取菌塊的方法接入搖瓶培養基內進行搖瓶初篩，搖瓶發酵條件：35 ℃，400 r/min。發酵72 h。搖瓶發酵結果如表1。

根據搖瓶初篩發酵產酸、轉化率結果，優選1#、3#、13#、14#、15#、16#六株菌株進入復篩。

（3） 搖瓶復篩

進入復篩的六株菌株，利用劃線法傳代斜面培養，35 ℃條件下，培養5 d。將培養成熟的斜面孢子做成孢子懸浮液，稀釋一定梯度，涂布PDA平板，培養24 h，菌落計數。這樣得到孢子懸浮液的濃度。然后按照一定的30萬/mL接種量接入配制好的搖瓶培養基中搖瓶發酵，根據發酵終點產酸，優選一株產酸高的菌株作為保藏的出發菌株。

根據搖瓶復篩發酵結果，優選一株菌球形態成菊花狀，松散適宜的、產酸高的菌株作為保藏菌株的出發菌株。

2 ?結果與分析

2.1 ?發酵結果判斷

35 ℃，400 r/min條件下，搖瓶發酵72 h。酸度檢測、鏡檢。

2.1.1 ?酸度的滴定

（1） 原理

檸檬酸與氫氧化鈉發生酸堿中和反應，用酚酞指示劑指示終點，溶液顏色由無色變成粉紅色，即為滴定終點。

（2） 主要試劑和溶液

（a） 0.142 9 mol/L標準氫氧化鈉溶液

（b） 0.5%酚酞指示劑。

（3） 主要儀器和設備

漏斗， 試管， 三角瓶（250 mL）， 吸管（1 mL），堿式滴定管（25 mL或50 mL）。

（4） 測定步驟

取1 mL發酵液于250 mL的錐形瓶，加適量蒸餾水，加1～2滴酚酞指示劑，用0.142 9 mol/L標準氫氧化鈉溶液滴定至粉紅色。

（5） 計算

所消耗的氫氧化鈉毫升數即為該溶液的檸檬酸酸度（w/v%）。

2.1.2 ?鏡檢

分別用60倍、150倍、600倍倍數下觀察菌球的整體形態、菌絲粗壯情況，并記錄下菌球的大小、松散度、菌絲長度以及有無雜菌、斷絲等。

2.2 ?高產菌株確定

結合搖瓶產酸及菌球形態，優選13#株產酸作為保藏菌株的出發菌。

2.3 ?斜面菌種制作

在無菌凈化工作臺上，利用劃線法，將出發菌的孢子傳至合格的空白斜面上，35 ℃，培養4～5 d。

2.4 ?菌種保藏

2.4.1 ?斜面保藏

將上述培養成熟菌株，放置干燥器內，4 ℃冰箱保藏即可。

2.4.2 ?沙土管保藏

（1） 沙土管菌種保藏

無菌凈化臺上，將接種環在火焰下滅菌后冷卻，取上述斜面培養基上長好的孢子接入到無菌的砂土管中（注意勿把培養基帶入）攪勻，塞緊塞子，置于盛有干燥劑的容器中，密封、低溫保藏即可。

（2） 沙土管保藏檢查

（a）每10支抽取一支，在無菌條件下，用接種環取出少量沙土粒，劃線于斜面培養基上，進行培養，觀察菌臺生長情況和產孢情況。

（b）35 ℃，培養24 h，觀察斜面生長情況。如果斜面出現雜菌或菌落數很少或基本不長，這說明制備的沙土管不合格，需重新制備。

（c）若經檢查沒有問題，放冰箱或室內干燥處保存。每半年檢查一次活力和雜菌情況。用此方法，通常可以保藏2～10 a時間不等[4]。

3 ?結果與討論

菌種保藏的方法很多，但總體上原理是一致的，即挑選優良的純的種子，最好是他們的休眠體（如芽孢、分生孢子等），外界創造一個使微生物代謝不活潑，生長受抑制的環境條件，如干燥、低溫、缺氧及缺乏營養（營養受限）、添加保護劑等，使保藏中的微生物不進行增值，也就很少發生突變[4]。

在微生物實驗室和生產、應用單位，保持菌種優良的性狀長期不衰退是一項重要而艱巨的工作。變異是生物的客觀規律，群體中突變細胞的生長優勢和個別細胞的自發突變是菌種退化的重要原因，傳代次數的增加和不適宜的培養條件是加速菌種退化的重要因素。控制傳代次數、創造良好的培養條件、利用性狀穩定的細胞進行傳代和采用有效的菌種保藏方法是防止菌種退化的有效措施[4]。在諸多的菌種保藏方法中，斜面保藏和沙土管保藏是目前生產常用的簡單、快捷的黑曲霉菌種保藏方法。

4 ?結 論

本文主要提供了兩種用于黑曲霉檸檬酸生產菌的常用保藏方法，根據不同需要，分別采用不同的保藏方法。斜面保藏法適用于短期保藏，保藏時間一般為1～2月，沙土管保藏適用于長期保藏，保藏時間為2～10 a[4]。

參考文獻：

[1]諸葛健，李華鐘. 微生物學[M]. 北京：科學出版社，2004-09.

[2]王博彥，金其榮. 發酵有機酸生產與應用手冊[M].北京：中國輕工業出版社，2000-01： 124-149.

[3] 陳儆，王立才，王彥波. 玉米淀粉工業手冊[M].北京：中國輕工業出版社， 2009-09.

[4] 檀耀輝，諸葛建，等. 微生物學[M]. 北京：輕工業出版社，1990-05.

[5] 盧宗梅，周勇，楊儒文， 等. 全清液發酵營養組學的精準控制[J].當代化工， 2019（4）.