異甘草酸鎂注射液聯合紫杉醇誘導乳腺癌細胞株凋亡及其機制

徐君南，李美靜，李曉睿，高志超，孫濤

乳腺癌是引起全世界范圍內女性腫瘤相關死亡的主要原因之一。近年來，大量治療乳腺癌的化療、內分泌和靶向藥物問世，顯著改善乳腺癌病人的生存預后。然而不幸的是絕大多數乳腺癌的病人最終往往對化療藥物耐受，從而導致治療失敗甚至死亡[1]。化療仍是乳腺癌治療的基石，如何提高化療藥物的抗腫瘤作用是臨床醫師的研究重點。紫杉醇是繼蒽環類藥物之后為乳腺癌病人治療的基石化療藥物，但體外研究表明藥物外排蛋白高表達或者乳腺癌干細胞等均可導致紫杉醇耐藥[2-3]。異甘草酸鎂(magnesium isoglycyrrhizinate，MGL)作為甘草酸的一種立體異構體，主要由天然甘草提取并堿化后制成鎂鹽形式，其生物學活性包括抗炎、肝保護、抗氧化和抗病毒等[4]。少部分臨床前及臨床研究表明異甘草酸鎂有一定抗腫瘤活性[5]，然而其對于乳腺癌細胞的影響及確切的作用機制尚不明確。本研究基于此，研究異甘草酸鎂單藥及聯合紫杉醇誘導乳腺癌細胞MCF-7凋亡作用，并探討其分子機制。

1 材料與方法

1.1材料本研究于遼寧省乳腺癌重點實驗室自2016年3月至2017年1月進行，乳腺癌細胞株MCF-7(購自中國科學院上海細胞庫)。異甘草酸鎂注射液(正大天晴藥業集團股份有限公司，生產批號160115104)，紫杉醇(百時美施貴寶有限公司，生產批號3L01986)由提供。β-actin抗體、pBcl-2單抗、Notch2單抗、Caspase-3多抗均購自于Abcam公司和CST公司。辣根過氧化物酶-結合抗兔的二抗、CCK-8試劑盒和增強化學發光溶液購自于上海碧云天生物技術有限公司。AnnexinV-FITC/PI凋亡試劑盒購于BD公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養 乳腺癌細胞株MCF-7置于含10%胎牛血清、l×108U/L青霉素、100 g/L鏈霉素的DMEM(高糖型)培養基中。調整細胞密度為105/mL置于培養瓶中，37 ℃、5%CO2的恒溫細胞孵育箱中連續培養。

1.2.2CCK-8法測細胞抑制 將細胞密度為5×104/mL-1MCF-7細胞接種在96孔培養板中，加入不同濃度的異甘草酸鎂注射液(0、0.1、0.3、1、3、10、30、100、300、1 000) μmol/L和10 μmol/L紫杉醇培養48 h，其加入CCK8反應液10 μL，4 h后在酶標儀波長為490 mm處測定各孔的光吸收值(OD值)，計算細胞增殖抑制率，實驗每組重復至少3次。

1.2.3流式細胞儀檢測凋亡率 設定陰性空白對照組、異甘草酸鎂注射液組、紫杉醇組、異甘草酸鎂注射液聯合紫杉醇(聯合)組四組，細胞24 h后收集，并加500 μL結合緩沖液再加5 μL 磷脂酰絲氨酸蛋白抗體(AnnexinV-FITC) 和5 μL 碘化丙啶(Propidium iodide，PI)試劑分別混合，室溫反應15 min。采用流式細胞儀測定不同組別的細胞早期凋亡和晚期凋亡情況。

1.2.4蛋白印跡法(Western Blot)檢測蛋白表達設定陰性空白對照組、異甘草酸鎂注射液組、紫杉醇組、異甘草酸鎂注射液聯合紫杉醇組四組，收集藥物處理24 h的蛋白，提取總蛋白并測定其濃度，采用Western Blot分別檢測β-肌動蛋白(β-actin)、磷酸化B淋巴細胞瘤-2基因(phosphate-B-cell lymphoma-2，pBcl-2)、半胱天冬酶 (cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase)-3以及缺口蛋白(Notch)通路Notch2蛋白表達情況。

2 結果

2.1異甘草酸鎂注射液、紫杉醇對MCF-7細胞的體外增殖抑制作用CCK8法檢測結果顯示：濃度在0.1～100 μmol/L之間的異甘草酸鎂注射液對MCF-7細胞的增殖抑制作用隨著藥物濃度的升高而增強，之后略有下降，在100 μmol/L達到最高峰，詳見圖1。不同濃度的異甘草酸鎂注射液聯合紫杉醇的CCK8檢測結果顯示：與單藥組對比，兩藥聯合組有較高的細胞增殖抑制率，尤其在100 μmol/L(60.89% 比 26.98%，t=-0.017，P<0.05)，兩藥相互作用指數q值分別為1.987，顯示異甘草酸鎂注射液聯合紫杉醇對乳腺癌MCF-7細胞的抑制具有一定協同作用。

圖1 不同濃度異甘草酸鎂注射液及聯合紫杉醇干預MCF-7細胞增殖抑制情況

2.2異甘草酸鎂注射液聯合紫杉醇促進MCF-7細胞凋亡AnnexinV-FITC/PI雙染流式細胞技術檢測結果顯示：空白對照組，100 μmol/L異甘草酸鎂、10 μmol/L紫杉醇、100 μmol/L異甘草酸鎂聯合10 μmol/L紫杉醇聯合組與MCF-7細胞的早期凋亡率差異有統計學意義(F=209.839，P<0.001)，且與空白對照組相比，100 μmol/L異甘草酸鎂、10 μmol/L紫杉醇、100 μmol/L異甘草酸鎂聯合10 μmol/L紫杉醇聯合組的早期凋亡率更高(均P<0.001)?？瞻讓φ战M，100 μmol/L異甘草酸鎂、10 μmol/L紫杉醇、100 μmol/L異甘草酸鎂聯合10 μmol/L紫杉醇聯合組與MCF-7細胞的晚期凋亡率差異有統計學意義(F=40.742，P<0.001)。與單藥組相比，100 μmol/L異甘草酸鎂、10 μmol/L紫杉醇、100 μmol/L異甘草酸鎂聯合10 μmol/L紫杉醇聯合組顯著增加MCF-7細胞的晚期凋亡率(均P<0.001)。見表1和圖2。

表1 異甘草酸鎂注射液、紫杉醇及聯合干預MCF-7細胞24 h的凋亡情況/(%，±s)

圖2 異甘草酸鎂注射液、紫杉醇及聯合組干預MCF-7細胞24 h的細胞流式圖

圖3 異甘草酸鎂注射液、紫杉醇及聯合組干預MCF-7細胞pBcl-2、Caspase-3和Notch2表達：A為pBcl-2、caspase-3和b-actin的Western Blot代表性條帶；B為Notch-2和b-actin的Western Blot代表性條帶；C為pBcl-2、caspase-3和b-actin的條帶灰度值比值匯總圖；D為Notch-2和b-actin條帶灰度值比值的匯總圖

2.3異甘草酸鎂注射液聯合紫杉醇增加MCF-7細胞凋亡相關蛋白表達空白對照組、異甘草酸鎂注射液組、紫杉醇組及聯合組分別干預MCF-7細胞后，凋亡相關蛋白pBcl-2在空白對照組、異甘草酸鎂注射液組、紫杉醇組和聯合組差異有統計學意義(F=11.064，P<0.001)，聯合組的pBcl-2蛋白表達均高于其他三組(1.94，0.79，0.83和1.01，均P<0.001)。Caspase-3蛋白表達在空白對照組、異甘草酸鎂注射液組、紫杉醇組和聯合組差異無統計學意義(F=2.287，P=0.11)；Notch2蛋白表達在空白對照組、異甘草酸鎂注射液組、紫杉醇組和聯合組差異無統計學意義(F=2.849，P=0.063)。異甘草酸鎂注射液與紫杉醇聯合組的Caspase-3蛋白表達高于空白對照組、異甘草酸鎂注射液組(3.17 比 2.01，P=0.027；3.17 比 2.13，P=0.046)，而與紫杉醇單藥組相當(3.17 比 2.46，P=0.160)。聯合組的Notch2蛋白表達與紫杉醇單藥組差異無統計學意義(1.17 比 0.82，P=0.121)，高于空白對照組、異甘草酸鎂注射液組(1.17 比 0.67，P=0.018；1.17 比 0.69，P=0.022)。詳見圖3。

3 討論

化療是乳腺癌綜合治療的基石，紫杉醇是繼蒽環類藥物之后為乳腺癌病人治療的化療藥物，但體外研究表明藥物外排蛋白高表達或者乳腺癌干細胞等均可導致紫杉醇耐藥[2-3]。異甘草酸鎂作為甘草酸的一種立體異構體，主要由天然甘草提取并堿化后制成鎂鹽形式，其生物學活性包括抗炎、肝保護、抗氧化和抗病毒等[4]。少部分臨床前及臨床研究表明異甘草酸鎂有一定抗腫瘤活性[5-6]。Arase等[7]在慢性丙肝病人進行不同時長甘草酸預處理的長期觀察，長時間服用(甘草酸2～16年)、短期服用(<2年)和未服用者，肝癌的發生率分別是7%、12%和25%，可見甘草酸具有抗腫瘤的作用，但需要長期服用。其分子機制探討中主要活性成分甘草次酸修復強致癌劑苯丙芘誘導的DNA損傷，以及抑制鳥氨酸脫羧酶激活作用。此外，甘草酸在子宮內膜癌、胃癌KATOⅢ細胞和白血病原髓細胞表現出抑制增殖作用[8]。然而，目前對于甘草酸在抗癌領域的研究也只是處于一個起步的階段，異甘草酸鎂單藥及聯合紫杉醇誘導乳腺癌細胞MCF-7凋亡及作用機制等尚不清楚，仍需要進一步的研究來探討。我們研究結果顯示濃度在0.1～100 μmol/L之間的異甘草酸鎂注射液對MCF-7細胞的增殖抑制作用隨著藥物濃度的升高而增強，之后略有下降，在100 μmol/L達到最高峰。100 μmol/L異甘草酸鎂聯合10 μmol/L紫杉醇聯合組顯著增加MCF-7細胞的早期凋亡率和晚期凋亡率。

異甘草酸鎂促進紫杉醇凋亡的機制探討發現聯合組的pBcl-2、Caspase-3蛋白表達均高于其他三組(P<0.05)；Bcl-2是抗凋亡蛋白，pBcl2為磷酸化Bcl2狀態，喪失了對細胞凋亡的抑制作用，造成線粒體等細胞器的功能喪失和細胞器內促凋亡因子的釋放，導致細胞凋亡。聯合組和紫杉醇組的Notch2蛋白表達相較于均增加空白對照組和異甘草酸鎂注射液單藥組。Notch信號通路參與細胞增殖、分化及凋亡。研究表明，乳腺癌細胞與乳腺癌干細胞中存在Notch信號途徑的異?；罨痆9-10]，并且這種異?；罨c內分泌及曲妥珠單抗治療耐受相關[11-12]。因此，靶定Notch信號途徑可能是一種治療轉移性乳腺癌的新策略。γ-分泌酶抑制劑(γ secretase inhibitors)可以阻斷Notch信號途徑活化所必須的細胞內溶蛋白性裂解過程，從而抑制腫瘤細胞及腫瘤干細胞增殖[13-15]。前期研究發現，紫杉醇單藥與Notch2活化相關，本研究進一步證實異甘草酸鎂能增強紫杉醇的促凋亡作用，與Notch2活化仍有關。

總之，異甘草酸鎂注射液協同促進紫杉醇誘導乳腺癌細胞(MCF-7細胞株)凋亡，其機制可能與促進紫杉醇通過Notch通路上調MCF-7細胞pBcl-2、Caspase-3凋亡蛋白表達有關，本研究為臨床上增效紫杉醇抗腫瘤作用提供了理論依據。