酸菜水中細菌多樣性研究

折米娜，望詩琪，趙慧君，郭壯,2，廖華，張振東*

(1.湖北文理學院食品科學技術學院，鄂西北傳統發酵食品研究所，湖北 襄陽 441053；2.恩施市公共檢驗檢測中心，湖北 恩施 445000；3.恩施市農業局，湖北 恩施 445000)

酸菜，是一種流行于東北、四川、貴州和云南等地區的傳統發酵食品[1]，通常以白菜或青菜為主要原料，經微生物自然發酵而成。由于制作環境相對開放，因而酸菜中微生物種類較為豐富[2]，且研究表明不同地區酸菜中乳酸菌的群系存在較大差異。東北地區自然發酵酸菜中的乳酸菌主要為植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)、短乳桿菌(Lactobacillusbrevis)、羅伊氏乳桿菌(Lactobacillusreuter)和米酒乳桿菌(Lactobacillussakei)[3]，而云南地區自然發酵酸菜中的乳酸菌主要為植物乳桿菌(Lactobacilllusplantarum)、短乳桿菌(Lactobacillusbrevis)和腸膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)[4]，亦有報道指出四川泡菜中的優勢菌群為植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)、腸膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)、短乳桿菌(Lactobacillusbrevis)和耐乙醇片球菌(Pediococcusethanoliduran)[5]。作為秦巴山區生物多樣性保育重要生態功能區，恩施土家族苗族自治州亦有制作和食用酸菜的習俗，然而目前關于該地區酸菜中微生物多樣性的研究報道尚少。

分子生物學技術被廣泛應用于微生物群落結構多樣性的研究，其中Illumina Miseq第二代高通量測序技術是直接將樣品的宏基因組擴增后進行測序，從而獲得不同環境下對應微生物的群落結構，不僅可以檢測到低豐度的微生物而且結果準確可靠[6]。聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)結合變性梯度凝膠電泳(denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE)是一種能快速、準確和高效鑒定自然環境或人工環境中微生物的種類，進而反映微生物群落結構組成的分析技術[7]。Illumina Miseq技術和PCR-DGGE技術均可以克服傳統純培養微生物學手段耗時長和工作量大等缺點，二者被廣泛應用于腸道微生物[8,9]、環境微生物[10,11]和食品微生物等領域[12,13]。

本研究以恩施土家族苗族自治州酸菜水為研究對象，采用Miseq高通量測序技術結合PCR-DGGE技術對細菌和乳酸菌多樣性進行了解析，并利用傳統微生物學手段對酸菜水中的乳酸菌進行了分離鑒定。通過本研究的開展，以期為恩施地區傳統發酵蔬菜的產業化提供數據支撐，同時為后續發酵食品中乳酸菌的開發提供菌株支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樣品：采購于恩施市土橋壩菜市場。

試劑：三羥甲基氨基甲烷、乙酸、乙二胺四乙酸、聚丙烯酰胺、N,N-亞甲基二丙烯酰胺、葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏、乙酸鈉、酵母粉、檸檬酸二銨、磷酸氫二鉀、七水合硫酸鎂、一水合硫酸錳和吐溫80：均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司；D5625-01 DNA提取試劑盒：美國OMEGA公司；DNA Marker(FERMENTAS)和PCR清潔試劑盒(AXYGEN)：京科博匯智生物科技發展有限公司；2PCR×mix：南京諾唯贊生物科技有限公司；rTaq、dNTPmix、pMD18-T vector：大連寶生物技術有限公司(TaKaRa)，由武漢天一輝遠生物科技有限公司合成；PCR引物合成和測序：由武漢天一輝遠生物科技有限公司完成。

1.2 儀器與設備

Miseq PE300高通量測序平臺 美國Illumina公司；R920機架式服務器 美國DELL公司；CT15RE冷凍離心機 日本HITACHI公司；Veriti 96-well thermal cycler PCR儀 美國AB 公司；NanoDrop 2000超微量分光光度計 美國Thermo Fisher公司；DCodeTMSystem 美國Bio Red公司；DYY-12電泳儀 北京六一儀器廠；FluorChem FC3 美國FluorChem公司；Bio-5000 plus掃描儀 上海中晶科技有限公司；DG250厭氧工作站 英國DWS公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品總DNA提取與檢測

采用OMEGA D5625-01試劑盒提取3個酸菜水樣品中的總DNA，提取成功后用0.8%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測并測定其DNA的濃度。

1.3.2 樣品細菌16S rRNA PCR擴增及Miseq高通量測序

擴增體系：4 μL 5×PCR緩沖液，2 μL 2.5 mmol/L dNTP Mix，0.8 μL 5 μmol/L正向引物，0.8 μL 5 μmol/L反向引物，0.4 μL 5 U/μL Taq酶，10 ng DNA模板，ddH2O補充至20 μL。其中引物為338F/806R。

擴增條件：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，循環30次；72 ℃延伸10 min。PCR擴增產物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后將濃度稀釋至100 nmol/L，寄至上海美吉生物醫藥科技有限公司進行Miseq高通量測序。

1.3.3 序列拼接及質量控制

下機序列參照王玉榮等[14]和蔡宏宇等[15]的方法進行質控，同時使用QIIME(V1.7.0)分析平臺進行生物信息學分析。使用PyNAST軟件將所有的序列對齊后，采用兩步UCLUST算法分別以100%和97%的相似度進行序列劃分并建立分類操作單元(operational taxonomic units，OTU)，從每個OTU中選取1條代表性序列，使用RDP(ribosomal database project)和Greengenes數據庫對序列進行同源性比對，通過對數據的整理確定各樣品種屬分類學地位，進而對酸菜水中的Chao 1指數和Shannona指數等指標進行計算。將在3個樣品中均存在的OTU定義為核心OTU。

1.3.4 基于PCR-DGGE技術酸菜水中乳酸桿菌多樣性解析

將1.3.1中DNA濃度調整一致后作為模板進行PCR擴增。乳桿菌16S rDNA基因片段PCR擴增所用的引物為：正向引物為LacF-GC(5'-CGC CCG GGG CGC GCC CCG GGC GGC CCG GGG GCA CCG GGG GCT CCT ACG GGA GGC AGC AGT-3')，反向引物為LacR(5'-GTA TTA CCG CGG CTG CTG GCA C-3')。PCR擴增體系為2.5 μL 10×PCR Buffer(含Mg2+)，2 μL dNTP(2.5 mol/L)，0.5 μL正向引物(10 mmol/L)，0.5 μL負向引物(10 mmol/L)，0.5 μL rTaq(5 U/μL)，1 μL DNA模板，ddH2O補充至25 μL。PCR反應條件為95 ℃ 4 min預變性，95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30個循環，最后在72 ℃延伸10 min。PCR擴增結束后，擴增產物用2%的瓊脂使用變性劑線性梯度為35%～52%，濃度為8%的聚丙烯酰胺(40%丙烯酰胺/N，N-亞甲基二丙烯酰胺)對樣品DNA的PCR產物進行變性梯度凝膠電泳。DGGE條件：點樣量為10 μL，電泳液為0.5 TAE，電泳溫度為60 ℃，電壓與時間為120 V，80 min，然后80 V，13 h。電泳結束后，對DGGE膠進行硝酸銀染色[16]，使用掃描儀對凝膠電泳圖進行觀察拍照，并對優勢條帶進行切膠并回收。回收的條帶用不含GC夾子的LacF和LacR引物進行擴增，擴增體系及條件與上述方法相同。將PCR擴增產物進行清潔純化，并與PMD18-T載體連接后轉化到大腸桿菌TOP10中，經單克隆鑒定為陽性后送往武漢天一輝遠生物科技有限公司進行測序。

將測序結果除去兩端載體的序列，然后使用BioEdit軟件將序列進行拼接。拼接結果在NCBI BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)中比對查詢，找出相似度高的相似序列用MEGA 5.0軟件制作系統發育樹。

1.3.5 酸菜水中乳酸菌的分離與鑒定

將酸菜水樣品進行倍比稀釋(稀釋度為10-5，10-6，10-7)，涂布于含有1.5% CaCO3的MRS固體培養基上，置于厭氧工作站在37 ℃培養48 h。挑取有透明圈的菌落進行劃線純化，并進行革蘭氏染色試驗及菌株的保藏。用CTAB法提取各純化菌株的DNA[17]，使用通用引物27F(5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3')和1495R(5'-CTA CGG CTA CCT TGT TAC GA-3')進行16S rRNA擴增。

PCR擴增體系：2.5 μL 10×PCR Buffer(含Mg2+)，2 μL dNTP(2.5 mol/L)，0.5 μL 27 f(10 mmol/L)，0.5 μL 1495 r(10 mmol/L)，0.5 μL rTaq(5 U/μL)，0.5 μL DNA模板，ddH2O補充至25 μL。

PCR擴增條件：95 ℃ 4 min預變性，95 ℃變性1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 90 s，30個循環，72 ℃延伸10 min。PCR擴增結束后，取擴增產物2.5 μL用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。檢測合格后，將PCR擴增產物進行清潔純化，并與PMD18-T載體連接轉化到大腸桿菌TOP10中，經單克隆鑒定為陽性后送往武漢天一輝遠生物科技有限公司進行測序。測序結果分析同1.3.5。

1.4 數據處理

通過Origin 8.5軟件進行各項數據的統計并作圖，熱圖由Matlab 2010b繪制，系統發育樹由BioEdit軟件和MEGA 5.0軟件共同繪制。

2 結果與分析

2.1 序列豐富度和多樣性分析

本研究首先將3個恩施地區酸菜水進行16S rRNA測序，其結果及各分類地位數量見表1。

表1 樣品16S rRNA測序情況及各分類地位數量

注：計算每個樣品Chao 1和Shannon指數時，樣品的測序量均為30510條序列。

本研究采集的3個酸菜水樣品共產生了117276條16S rRNA序列。根據100%的相似性進行序列劃分共得到60342條代表性序列，根據序列的97%相似性進行OTU劃分后，共得到4473個OTU，每個樣品平均1419個。由表1可知，SCS02樣品具有最大的細菌物種豐度，其Chao 1指數為1013，而SCS03樣品細菌多樣性最高，其Shannon指數為6.20。

2.2 基于不同分類地位酸菜水樣品核心細菌菌群相對含量分析

納入本研究的序列被鑒定為7個門、15個綱、29個目、38個科和58個屬，其中只有0.37%的序列不能鑒定到屬水平。本研究的3個酸菜水樣品中平均相對含量>1%的細菌門分別為硬壁菌門(Firmicutes)和變形菌門(Proteobacteria)，其相對含量分別為97.78%和1.96%。值得一提的是，3個樣品中隸屬于硬壁菌門(Firmicutes)的細菌相對含量分別為98.10%，95.28%，99.95%。基于屬水平3個酸菜水樣品中優勢細菌的相對含量見圖1。

圖1 酸菜水中優勢細菌屬相對含量的比較分析

由圖1可知，優勢細菌屬分別為隸屬于硬壁菌門(Firmicutes)的乳酸桿菌屬(Lactobacillus)和片球菌屬(Pediococcus)，其平均相對含量分別為76.25%和15.80%。通過采用454焦磷酸測序技術，李欣蔚等對16 份東北傳統自然發酵酸菜汁樣品中的細菌多樣性進行了解析，研究發現厚壁菌門(Firmicutes)和變形菌門(Proteobacteria)為其優勢細菌門，而乳桿菌屬(Lactobacillus)、假單胞菌(Pseudomonas)和明串珠菌屬(Leuconostoc)為其優勢菌屬[18]。利用構建16S rRNA基因文庫的方法，曹碧璇等對遼寧地區農家自然發酵酸菜液中的微生物多樣性進行了研究，結果發現乳酸桿菌屬(Lactobacillus)、片球菌屬(Pediococcus)和枸櫞酸桿菌屬(Citrobacter)是酸菜發酵液中的優勢菌[19]。利用Illumina高通量測序技術，佟婷婷對四川農家泡菜中的細菌多樣性進行了研究，結果發現四川地區泡菜中的優勢菌是乳桿菌屬(Lactobacillus)，且含量達到80%～85%[20]。利用PCR-DGGE技術，烏日娜對東北地區發酵酸菜中的微生物多樣性進行解析時發現乳酸桿菌屬(Lactobacillus)為其中的優勢細菌屬[21]。由此可見，雖然不同地區制作酸菜的工藝和原料不同，但是乳酸桿菌均為其優勢細菌屬。

本研究進一步統計了OTU在3個樣品中出現的次數，結果發現出現1次和2次的OTU分別為3759個和530個，分別占OTU總數的84.04%和11.85%，所包含的序列數為8946條和25678條。同時核心OTU為184個，占OTU總數的4.11%，所包含的序列數為82437條，經分析發現在184個核心OTU之中有11個OTU的相對含量大于1%。本研究進一步對11個核心OTU在3個酸菜水樣品中的相對含量進行了分析，結果見圖2。

圖2 平均相對含量大于1.0%的核心OTU在酸菜水樣品中相對含量的熱圖

由圖2可知，在11個核心OTU中，10個隸屬于乳酸桿菌屬(Lactobacillus)，只有OTU3578隸屬于片球菌屬(Pediococcus)，11個核心OTU的累計相對含量達47.68%。部分OTU在3個樣品中的相對含量差異較大，其中OTU3578在SCS01和SCS02中的相對含量分別為5.24%和5.69%，而在SCS03中的相對含量為27.17%；OTU1679在SCS01和SCS02中的相對含量分別為0.77%和0.17%，而在SCS03中的相對含量為19.27%。

2.3 酸菜水中乳桿菌DGGE圖譜及系統發育分析

在對酸菜水樣品進行Miseq高通量測序后，本研究進一步使用PCR-DGGE技術對3個樣品乳酸桿菌屬的多樣性進行了分析。由于不同樣品乳酸桿菌的群落結構不同，在變性梯度凝膠電泳后會分離出數目不等的條帶。分離出的條帶數目越多，說明樣品微生物多樣性越豐富，同時各條帶的亮度在一定程度上亦能說明微生物的豐度存在差異[22]。酸菜水中乳酸桿菌的PCR-DGGE電泳圖見圖3。

圖3 酸菜水中乳酸桿菌PCR-DGGE電泳圖

注：01，02，03分別為SCS01，SCS02，SCS03。

由圖3可知，指紋圖譜中共有8條條帶較為明亮，其中條帶3和條帶4在所有樣品中均存在，但亮度不一致；條帶6和條帶8存在于SCS01和SCS02中，亮度亦不一致；條帶1僅存在于SCS02樣品中，條帶2僅存在于SCS01樣品中，條帶5和條帶7僅存在于SCS03樣品中。由此可見，不同酸菜樣品間乳酸桿菌的多樣性亦存在一定的差異。本研究進一步對各條帶進行了序列分析，結果見表2。

表2 酸菜水中乳桿菌DGGE條帶比對結果

由表2可知，8個特異性條帶均屬于乳酸桿菌屬，且各條帶序列與現有數據庫中已知16S rDNA序列都具有較高的相似度。其中條帶2，3，8為植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)，條帶4和條帶5為發酵乳桿菌(Lactobacillusfermentum)，條帶1為面包乳桿菌(Lactobacilluspanis)，條帶6為短乳桿菌(Lactobacillusbrevis)，條帶7為Lactobacillusrennini。本研究進一步將鑒定結果與數據庫中的模式菌進行了系統發育樹的構建，結果見圖4。

圖4 系統發育樹

由圖4可知，系統發育樹分為兩大支，條帶1，2，3，4，5，6，8均在同一分支上，這表明上述菌株的親緣關系較近，而條帶7在另一分支上，這可能是由于該菌株的進化關系較其他菌株較遠導致的。武俊瑞等[23]利用PCR-DGGE技術對東北自然發酵酸菜中乳酸菌的多樣性進行了分析，在5 份酸菜中共鑒定出9 株乳酸菌，其中優勢乳酸菌是植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)和短乳桿菌(Lactobacillusbrevis)，而周金明等[24]利用PCR-DGGE技術對不同發酵時期酸菜發酵液微生物菌群進行了研究，結果發現植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)和清酒乳桿菌(Lactobacillussakei)是酸菜發酵過程中的優勢菌，其研究的結果與本研究相同。

2.4 酸菜水中乳酸菌分離鑒定結果

本研究進一步使用含有1.5% CaCO3的MRS培養基對3個酸菜水樣品進行了乳酸菌的分離鑒定，測序比對結果見表3。

表3 酸菜水中16S rDNA基因序列比對結果

由表3可知，從3個樣品中共分離出8株植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)、2株短乳桿菌(Lactobacillusbrevis)、2株發酵乳桿菌(Lactobacillusfermentum)和1株棒狀乳桿菌(Lactobacilluscoryniformis)，這進一步證實恩施地區酸菜水中的乳酸菌具有較高的多樣性。

3 結論

本研究采用Miseq高通量測序技術與PCR-DGGE技術相結合的方法對恩施地區酸菜水中的微生物多樣性進行了解析，同時利用傳統微生物純培養方法分離乳酸菌。結果發現，酸菜水樣品中的細菌微生物主要是隸屬于硬壁菌門的乳桿菌屬和片球菌屬，其中乳酸桿菌屬是優勢屬，經PCR-DGGE和純培養的方式進一步發現酸菜水中的優勢乳酸菌為植物乳桿菌。通過本研究可知傳統發酵酸菜中蘊含著豐富的微生物資源，其中以乳酸菌最為豐富，而乳酸菌作為一種益生菌被廣泛應用于各類食品加工中，這為傳統發酵食品的產業化生產提供了有利條件。