3種香辛料提取物抑菌及揮發(fā)性成分的研究

孟君，彭秀麗，張峻松，羅立強

(1.鄭州輕工業(yè)學(xué)院 食品與生物工程學(xué)院, 鄭州 450002；2.食品生產(chǎn)與安全河南省協(xié)同創(chuàng)新中心，鄭州 450002；3.鄭州鐵路職業(yè)技術(shù)學(xué)院 藥學(xué)系，鄭州 451460；4.上海大學(xué) 化學(xué)系，上海 200444)

八角、辣椒、花椒屬于天然食用香辛料，它們是常見的調(diào)味品,與人們的生活息息相關(guān)，富含大量的營養(yǎng)成分，是一類含有各種揮發(fā)性香氣成分，能賦予食品香味的天然物質(zhì)。

八角(Illiciumverum)又名大茴香，是木蘭科八角屬植物，其干燥成熟果實為我國的特產(chǎn)香辛料和中藥，也是居家必備的調(diào)料[1]。八角在食品調(diào)味料中占據(jù)著極其重要的地位，已作為香辛料在中國使用數(shù)百年，用作增香矯味和調(diào)制鹵湯，深受消費者喜愛，被稱為“飲食行業(yè)的大料”[2-4]。近年來的研究表明，其具有較好的抑菌、殺蟲活性和抗自由基氧化作用[5，6]

辣椒為茄科植物辣椒(CapsicumfrutescensL.)的果實，其作為食品和藥品應(yīng)用已有幾個世紀(jì)[7]。辣椒中含有多種有效成分如色素、辣椒堿、維生素、有機酸、蛋白質(zhì)、糖和礦物質(zhì)等[8]。現(xiàn)代藥理研究表明：辣椒提取液具有廣泛的抑菌活性，辣椒素就是其中最主要的辣味物質(zhì)和活性成分[9]。

花椒(ZanthoxylumbungeanumMaxim.)為蕓香科落葉灌木或小喬木蜀椒的果實，被譽為“八大調(diào)味品”之一，花椒中含有豐富的生物活性物質(zhì)，是中國、日本和東南亞國家和地區(qū)食品工業(yè)、餐飲業(yè)和家庭烹飪常用的香辛調(diào)味料和中藥配料[10]。《中華人民共和國藥典》中規(guī)定花椒為傳統(tǒng)中藥， 記載它有“溫中止痛、殺蟲止癢”的功效[11]。

隨著食品工業(yè)的發(fā)展和人們對食品安全和營養(yǎng)要求的提高，以食品抑菌、防腐為目的的研究不斷深入，由于化學(xué)抗菌劑的安全性受到挑戰(zhàn)，天然的食品添加劑憑借著具有化學(xué)合成劑無法比擬的安全優(yōu)勢，越來越被推崇。尋找廣譜、高效、無毒、天然的新型食品防腐劑已成為當(dāng)前食品添加劑研究的主流[12]。而植物和香辛料長久以來一直被中醫(yī)用于預(yù)防或治療傳染病，西醫(yī)也正在嘗試著把它們應(yīng)用于治療中。關(guān)于藥用植物和香辛料的抗微生物活性的研究已經(jīng)成為一種趨勢[13]，從香辛料中提取有效成分作為食品天然防腐劑具有廣闊的前景。本文研究八角、辣椒、花椒3種提取物對所選對象菌的抑菌效果，并對它們的揮發(fā)性化學(xué)成分進(jìn)行鑒定分析， 以期為香辛料作為食品天然防腐劑的開發(fā)提供一定的理論依據(jù)。

1 實驗材料與儀器

1.1 材料、試劑與方法

1.1.1 材料

八角、紅辣椒、花椒：為市售干制品，購于鄭州市金水區(qū)一家人超市。

菌種：大腸桿菌(Escherichiacoli)；枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)；金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)，由鄭州輕工業(yè)學(xué)院食品與生物工程學(xué)院生物工程實驗室提供。

1.1.2 主要試劑

無水乙醇、無水硫酸鈉、氫氧化鈉、NaCl(氯化鈉) (均為AR)：天津市德恩化學(xué)試劑有限公司；牛肉浸膏、蛋白胨、瓊脂粉(均為BR)：北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠。

1.2 主要儀器

ZN-500A粉碎機 常州日宏粉體設(shè)備廠；DHG-9145A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科技有限公司；HH-S4數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市醫(yī)療儀器廠；SHB-3循環(huán)水式多用真空泵 鄭州杜甫儀器廠；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；LX-C35立式自動電熱壓力蒸汽滅菌鍋 合肥華泰醫(yī)療設(shè)備有限公司；SW-CJ-IFD凈化工作臺 蘇州凈化設(shè)備有限公司；HZC-250全溫振蕩培養(yǎng)箱 太倉市實驗設(shè)備廠；JY1001電子天平 上海浦春計量儀器有限公司；GC6890-5973MS氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國安捷倫公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品的提取

將干八角、花椒、紅辣椒先在40 ℃干燥4 h，用粉碎機粉碎，分別稱取干八角、花椒、辣椒粉末50 g放入500 mL的圓底燒瓶內(nèi)，加入200 mL的無水乙醇，78 ℃回流提取4 h。抽濾得濾液，轉(zhuǎn)移至500 mL的圓底燒瓶內(nèi)，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器進(jìn)行真空濃縮(40 ℃，0.08 MPa)，蒸出乙醇，得到一定體積的濃縮液，加入少量的無水硫酸鈉，于4℃冰箱中干燥過夜，保藏備用。

1.3.2 培養(yǎng)基的制備

牛肉膏、蛋白胨、瓊脂培養(yǎng)基，其中的牛肉膏為微生物提供碳源、磷酸鹽和維生素，蛋白胨主要提供氮源和維生素，而NaCl提供無機鹽。

牛肉膏、蛋白胨、瓊脂培養(yǎng)基配方：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，瓊脂15～20 g，蒸餾水1000 mL，pH值7.4～7.6，121 ℃ 滅菌20 min。

1.3.3 供試菌種的活化

將經(jīng)高壓蒸汽滅菌的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基在無菌培養(yǎng)皿中制成平板，待培養(yǎng)基凝固后，分別用接種環(huán)按無菌操作進(jìn)行平板劃線：大腸桿菌(Escherichiacoli)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，放入-4 ℃冰箱內(nèi)儲藏備用。

1.3.4 供試菌懸液的制備

把2個經(jīng)高壓滅菌的裝有50 mL液體培養(yǎng)基的250 mL的三角瓶放入超凈工作臺，打開超凈工作臺紫外線燈照射15 min，關(guān)閉紫外線燈，打開白熾燈和風(fēng)機。分別挑取大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌單菌落接種于液體培養(yǎng)基。37 ℃，180 r/min恒溫?fù)u床培養(yǎng)5 h，得菌懸液，放入4 ℃冰箱內(nèi)保藏待用。

1.3.5 含菌雙疊平板的制備

待預(yù)先準(zhǔn)備好，并經(jīng)高溫高壓(121 ℃，20 min)滅菌的培養(yǎng)基溫度降到50～60 ℃時，將制備好的菌懸液倒入培養(yǎng)基中(菌懸液與培養(yǎng)基的體積比為1∶20)，充分混合均勻，制成含菌雙碟平板，冷卻備用。

1.3.6 抑菌效力的測定

牛津杯法：將牛津杯、移液槍頭、鑷子等器皿滅菌后，于超凈工作臺內(nèi)，用無菌鑷子把牛津杯置于含菌平板表面，再分別吸取八角、花椒、辣椒乙醇提取液50 μL注入牛津杯中，每種菌設(shè)置3個平行。然后將平皿置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h。按時取出，測量抑菌圈直徑，數(shù)據(jù)取平均值。

判斷標(biāo)準(zhǔn)：牛津杯直徑為8 mm，抑菌圈直徑大于9 mm才被評價為有抑菌效果。

1.3.7 八角提取液的GC-MS分析

取適量上述制備的2種樣品提取液，分別放于試管中，加入適量的無水硫酸鈉，放置過夜后，以無水硫酸鈉不結(jié)塊為宜，過濾，取適量干燥過濾后的八角、花椒、辣椒提取液，用GC-MS分析提取液中揮發(fā)性有機成分。

1.3.7.1 GC條件

柱子類型：HP-5MS(60 m×0.25 mm,0.25 μm)；升溫程序：50 ℃保持3 min，以4 ℃/min升至280 ℃，保持10 min；進(jìn)樣口溫度：260 ℃；傳輸線：270 ℃；分流比：5∶1；進(jìn)樣體積：1 μL；溶劑延遲時間：6 min。

1.3.7.2 MS條件

EI源電子能量70 eV，電子倍增器電壓1650 eV，質(zhì)量掃描范圍：30～550 amu，離子源溫度230 ℃，四極桿溫度130 ℃，對采集到的質(zhì)譜圖采用GC-MS計算機聯(lián)機分析法，與譜庫Nist02對比分析鑒定各成分。

2 結(jié)果與討論

2.1 八角、辣椒、花椒提取物對3種菌的抑制作用

采用牛津杯法，以上述幾種辛辣調(diào)味料的乙醇提取液分別測定對3種菌的抑菌作用，不同辛辣調(diào)味料對3種菌抑菌性的具體抑菌平板效果圖見圖1～圖3。用尺子量得各抑菌圈的直徑大小，得出3種調(diào)味料的乙醇提取物對3種細(xì)菌的抑菌活性，見表1。

圖1 八角、辣椒、花椒提取液對大腸桿菌的抑菌作用

圖2 八角、辣椒、花椒提取液對枯草芽孢桿菌的抑菌作用

圖3 八角、辣椒、花椒提取液對金黃色葡萄球菌的抑菌作用

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由表1可知，八角乙醇提取液對供試菌株的生長具有較好的抑制作用，其中，對金黃色葡萄球菌的抑制作用最好；辣椒乙醇提取液只對金黃色葡萄球菌有抑制作用；花椒乙醇提取液無抑菌作用。

2.2 八角揮發(fā)性成分分析

將1.3.1制得對花椒、八角、辣椒的提取物，經(jīng)GC-MS分析，得到樣品的總離子流色譜圖和各峰質(zhì)譜圖，經(jīng)數(shù)據(jù)庫檢索，采用計算機對各峰的質(zhì)譜圖進(jìn)行Nist標(biāo)準(zhǔn)譜庫的檢索，根據(jù)質(zhì)譜裂解規(guī)律進(jìn)行核對，參考標(biāo)準(zhǔn)圖譜和相關(guān)文獻(xiàn)確定其化學(xué)結(jié)構(gòu)。對各色譜峰進(jìn)行面積積分得到各峰面積的相對含量。選取比配度大于38%的數(shù)據(jù)，分離鑒定出了八角、辣椒、花椒主要揮發(fā)性成分，結(jié)果見表2～表4。

表2 八角主要揮發(fā)性香氣成分及含量

注：本表顯示的是比配度大于38的數(shù)據(jù)。

由表2可知，八角中的揮發(fā)性香氣成分比較復(fù)雜，酮、醛、酸、酯、酚、醚等，其中僅茴香腦就占一半以上，面積百分比為59.4568%。此外，所鑒定的成分中存在較多的同分異構(gòu)體，如順式-13-硬脂酸和反式-13-硬脂酸、油酸和反油酸。

表3 辣椒主要揮發(fā)性香氣成分及含量

注：本表顯示的是比配度大于38的數(shù)據(jù)。

由表3可知，辣椒中的揮發(fā)性香氣成分含量最高的也是茴香腦(22.7613%)；其次為順-11-十八碳烯酸(17.2643%)。油酸、亞油酸是自始至終都有的成分。此外，還含有一個特征成分——辣椒素(12.5766%)。

表4 花椒主要揮發(fā)性香氣成分及含量

續(xù) 表

由表4可知，花椒中的揮發(fā)性香氣成分主要為低分子量的烷烴和烯烴，其中1-己烷含量最高，面積百分比為23.2288%；其次為3-甲基己烷，面積百分比為18.6205%；其次為2，3，4-三甲基正己烷(10.6317%)；其次為2，2-二甲基丁烷(8.7596%)； 其次為正庚烷(7.9338%)，這5種物質(zhì)的總含量達(dá)到69.1744%。此外，還含有4.1965%的茴香腦。

3 結(jié)論

本文采用普通蒸餾法，以乙醇為提取劑，對3種常見的辛辣調(diào)味料花椒、八角、辣椒進(jìn)行提取，以乙醇提取物對3種常見的細(xì)菌做了抑菌性實驗，結(jié)果表明：八角乙醇提取液對供試菌株均有較好的抑制作用，其中，對金黃色葡萄球菌的抑制作用最好；辣椒乙醇提取液對金黃色葡萄球菌有一定的抑制作用；花椒乙醇提取液對3種供試菌均無抑制作用。

通過GC-MS分析提取物的主要香氣成分，共分離鑒定出八角、花椒中的主要揮發(fā)性化合物各有27種。八角中含有較多的同分異構(gòu)體，主要揮發(fā)性香氣成分中，茴香腦的相對質(zhì)量占總成分的一半以上。花椒提取物中茴香腦的相對含量的4.1965%，有機成分中大多以低分子量的烷烯為主；辣椒提取液中的揮發(fā)性主要有機成分有30種，含量最高的也是茴香腦，其相對含量為22.7613%，辣椒中含有較高特有活性成分辣椒素，活性成分辣椒素的相對含量為12.5766%。Rohloff等14]從八角中分離得到茴香腦及其有效物質(zhì)，即[3R-(3,4,5)]-3,4,5-三羥基-1-環(huán)己烯-1-羧酸物質(zhì)，對傷寒沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、蠟狀芽孢桿菌和大腸桿菌等有較強的抑制作用。3種提取物中都含有一定量的茴香腦，其中八角中的含量最高，辣椒次之，花椒最少，從3種提取物的抑菌性來看，八角乙醇提取物對3種細(xì)菌都有抑制作用，辣椒提取物只對金黃色葡萄球菌有抑制作用，花椒提取物的抑菌作用不明顯，由此可推斷，茴香腦可能是這幾種調(diào)味料具有抑菌活性的主要活性物質(zhì)。提取物中具體是哪些成分具有抑菌活性還不是很清楚，對此，還需要進(jìn)一步加強對其抑菌活性物質(zhì)的分離鑒定及應(yīng)用研究。

“民以食為天，食以味為先”，隨著食品工業(yè)的快速發(fā)展和消費者對“保健、安全、回歸自然”飲食意識的不斷加強[15]，八角、辣椒、花椒作為重要的天然調(diào)味料，揮發(fā)性香氣成分較多，八角、辣椒具有一定的抑菌作用，這種無毒無副作用的辛辣調(diào)味品作為防腐劑具有廣闊的開發(fā)與應(yīng)用前景，該研究為香辛料資源在食品天然防腐劑中的開發(fā)利用提供了理論依據(jù)和支持。