反相高效液相色譜法測(cè)定醬油中的呈味核苷酸

黃文武，馮緯，黃光榮

(1.湖州市食品藥品檢驗(yàn)研究院，浙江 湖州 313000；2.杭州市食品釀造有限公司，杭州 310021；3.中國(guó)計(jì)量大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，杭州 310018)

肌苷酸二鈉和鳥(niǎo)苷酸二鈉是2種主要的呈味核苷酸，常用于食品的增味，是我國(guó)GB 2760—2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》中規(guī)定可以按生產(chǎn)需要量添加的食品添加劑。在食品中，呈味核苷酸與谷氨酸鈉共用可起到相乘作用，大大提升食品鮮味；同時(shí)對(duì)甜味和肉味也有增效作用，對(duì)咸味、苦味、焦味等有抑制作用，因此，在許多加工食品中有添加。為提升醬油的鮮味，通常也有添加，同時(shí)呈味核苷酸的含量也是衡量鮮味的指標(biāo)之一[1-3]。為有效確定醬油產(chǎn)品中呈味核苷酸的含量及生產(chǎn)過(guò)程中添加量的控制，有必要建立相對(duì)快速、操作簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確的定量分析方法。

目前呈味核苷酸的檢測(cè)方法主要有紫外分光光度法[4,5]、過(guò)碘酸鈉氧化分光光度法和液相色譜法等[6，7]，其中紫外分光光度法適合于純度較高、干擾少的樣品測(cè)定，如呈味核苷酸原料、雞精產(chǎn)品等；過(guò)碘酸鈉氧化分光光度法檢出限太高，也不適合于醬油產(chǎn)品中呈味核苷酸的檢測(cè)；高效液相色譜法是目前檢測(cè)食品中呈味核苷酸最為常見(jiàn)的方法，但是各種液相色譜檢測(cè)條件，如緩沖液、色譜柱，明顯影響檢測(cè)精度、檢測(cè)限、分離度、檢測(cè)效率等。本研究擬改進(jìn)液相色譜法，應(yīng)用于醬油樣品中2種呈味核苷酸的測(cè)定，大大提升檢測(cè)效率。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

醬油樣品：購(gòu)于當(dāng)?shù)爻?；呈味核苷?肌苷酸二鈉和鳥(niǎo)苷酸二鈉)標(biāo)準(zhǔn)品：購(gòu)自Sigma公司；甲醇：色譜純；其他：分析純；實(shí)驗(yàn)用水：均為超純水；C18固相萃取小柱：Waters Sep-Pak C18小柱，3 mL/支。

1.2 儀器與設(shè)備

2695e型高效液相色譜儀(配二極管陣列檢測(cè)器) 美國(guó)Waters公司；Waters Sunfire C18柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)；CT14RD型高速冷凍離心機(jī) 上海天美科技有限公司；AB204CN型分析天平 上海賽多利斯有限公司；GM-0.33A型隔膜真空泵 天津市騰實(shí)實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；DELTA320型pH計(jì) 上海梅特勒-托利多儀器公司；KQ5200E型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品前處理

準(zhǔn)確移取2.0～5.0 mL生抽或老抽醬油到50 mL容量瓶中，加入75%甲醇溶液并定容，靜置30 min，移取10.0 mL到離心管中，于10000 r/min下離心15 min，取上清液5.0 mL，用蒸餾水稀釋1倍后，流經(jīng)事先經(jīng)過(guò)活化的C18固相萃取小柱，棄去前1 mL濾液，收集中間濾液5 mL左右，經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾后上機(jī)進(jìn)樣測(cè)定。

1.3.2 色譜條件

本實(shí)驗(yàn)所選用的色譜柱為Waters Sunfire C18色譜柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)，經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)后確定50 mmol/L pH 4.6的磷酸緩沖液進(jìn)行等梯度洗脫，流速為1.0 mL/min，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm，進(jìn)樣量為10 μL，柱溫為30 ℃。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線

準(zhǔn)確稱取200.0 mg肌苷酸二鈉和鳥(niǎo)苷酸二鈉標(biāo)準(zhǔn)品，用蒸餾水溶解后轉(zhuǎn)移到100 mL容量瓶中，并定容至刻度，此即濃度為2.0 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)使用液。準(zhǔn)確移取標(biāo)準(zhǔn)使用液0.25，0.50，1.25，2.50，5.00 mL標(biāo)準(zhǔn)使用液，用蒸餾水定容到100 mL，配成濃度分別為5.00，10.00，25.00，50.00，100.00 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作液。按1.3.2色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，以峰面積為縱坐標(biāo)，呈味核苷酸濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4 加標(biāo)回收

取醬油樣品，添加2.0 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)使用液使加標(biāo)濃度為50，400，1000 mg/L，用蒸餾水適當(dāng)稀釋(中高濃度加標(biāo)時(shí)稀釋倍數(shù)增加)后，取樣，按樣品前處理方法提取、脫色、除雜，并測(cè)定樣品中呈味核苷酸含量，平行測(cè)定6次。

1.4 數(shù)據(jù)處理

測(cè)定數(shù)據(jù)以平均值表示。統(tǒng)計(jì)分析及作圖在Origin V8.5下完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的確定

肌苷酸和鳥(niǎo)苷酸中核苷均有共軛雙鍵，在紫外區(qū)260 nm附近有強(qiáng)吸收，因此，選擇254 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。流動(dòng)相對(duì)色譜分離影響極大，實(shí)驗(yàn)了蒸餾水、甲醇、乙酸-乙酸鈉緩沖液和磷酸緩沖液作為流動(dòng)相，觀察IMP和GMP的分離情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以蒸餾水和甲醇作為流動(dòng)相，IMP和GMP根本不能分離；以50 mmol/L pH 4.6的乙酸-乙酸鈉緩沖液為流動(dòng)相時(shí)，IMP和GMP雖然能分離，但分離度不夠，峰形也較差，如果用于定量直接影響檢測(cè)結(jié)果的精密度和準(zhǔn)確性；以50 mmol/L pH 4.6的磷酸緩沖液為流動(dòng)相時(shí)GMP與IMP分離度較好，峰形也對(duì)稱，出峰時(shí)間分別為12.2，13.8 min。因此，最后選擇50 mmol/L pH 4.6的磷酸緩沖液為流動(dòng)相、流速1.0 mL/min、紫外254 nm檢測(cè)、進(jìn)樣量10 μL、柱溫30 ℃作為色譜條件。

2.2 色譜圖與標(biāo)準(zhǔn)曲線

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)建立的色譜條件，GMP和IMP的保留時(shí)間均在25 min左右，且各峰形良好，表明該方法的分離效果較好，紫外檢測(cè)器較為穩(wěn)定，準(zhǔn)確性較高。生抽醬油樣品加標(biāo)GMP和IMP前后的色譜圖見(jiàn)圖1，加標(biāo)前后GMP和IMP位置峰區(qū)分度仍很好，可應(yīng)用于定量檢測(cè)。分別準(zhǔn)確配制5.00～50.00 mg/L GMP和IMP標(biāo)準(zhǔn)溶液6個(gè)不同濃度梯度，進(jìn)行色譜測(cè)定。以IMP或GMP出峰面積(y)為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度(x)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見(jiàn)圖2。IMP或GMP濃度在5～50 mg/L范圍內(nèi)，峰面積與濃度呈線性關(guān)系，線性回歸方程為IMP：y=-1755+16866x，R2=0.9999；GMP：y=-8813+18704x，R2=0.9999。

圖1 高效液相色譜法測(cè)定醬油中GMP和IMP色譜圖

圖2 高效液相色譜法測(cè)定GMP和IMP標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 精密度、檢出限和定量限的確定

取1份醬油樣品，按前述確定的測(cè)定條件重復(fù)測(cè)定10次，其GMP和IMP測(cè)定值見(jiàn)表1。其變異系數(shù)分別為2.08%和1.83%，均小于5%，表明本實(shí)驗(yàn)所用HPLC測(cè)定方法的精密度高，檢測(cè)結(jié)果較為理想。

表1 某醬油樣品重復(fù)10次測(cè)定值

續(xù) 表

將GMP和IMP標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋到1.0 mg/L，進(jìn)行平行10次測(cè)定，峰面積見(jiàn)表2。以此計(jì)算峰面積標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為718和309，按3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差對(duì)應(yīng)的GMP和IMP濃度值分別為0.52，0.23 mg/L，10倍標(biāo)準(zhǔn)偏差對(duì)應(yīng)的GMP和IMP濃度值分別為1.74，0.77 mg/L。因此，確定該方法對(duì)GMP和IMP的檢出限分別為0.52，0.23 mg/L，定量限分別為1.74，0.77 mg/L。

表2 GMP和IMP標(biāo)準(zhǔn)溶液重復(fù)10次測(cè)定峰面積

2.4 樣品的檢測(cè)與加標(biāo)回收

采用建立的方法，測(cè)定了2種代表性醬油(生抽和老抽)樣品中的GMP和IMP含量，每個(gè)測(cè)定取6次平行測(cè)定的平均值，并計(jì)算變異系數(shù)。同時(shí)，在2個(gè)樣品中進(jìn)行加標(biāo)測(cè)定，分別以加標(biāo)濃度為50，400，1000 mg/L進(jìn)行3種濃度加標(biāo)，并平行測(cè)定6次，計(jì)算加標(biāo)回收率，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 醬油樣品中呈味核苷酸含量測(cè)定及加標(biāo)回收率

續(xù) 表

由表3可知， 在這2種醬油樣品中均檢出GMP和IMP，其中老抽樣品中含量較低，生抽中含量較高。3種濃度的加標(biāo)回收率結(jié)果表明，GMP平均回收率在90.0%～105.0%之間，IMP平均回收率在90.0%～101.3%之間，平行測(cè)定變異系數(shù)也在5%以內(nèi)，均符合檢測(cè)要求，說(shuō)明該方法的準(zhǔn)確性較高。

3 結(jié)論

以市售釀造醬油(生抽、老抽)為研究對(duì)象，建立了一種具有較好重現(xiàn)性、較高靈敏度和準(zhǔn)確性的反相高效液相色譜方法，用于測(cè)定醬油產(chǎn)品中呈味核苷酸的含量。優(yōu)化后的色譜條件為：50 mmol/L pH 4.6的磷酸緩沖液為流動(dòng)相、流速1.0 mL/min、紫外254 nm檢測(cè)、進(jìn)樣量10 μL、柱溫30 ℃。通過(guò)方法學(xué)分析論證了所建立方法的準(zhǔn)確性較高，將該方法應(yīng)用于市售釀造醬油中呈味核苷酸的檢測(cè)，并進(jìn)行了加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明該法可應(yīng)用于醬油中IMP和GMP的檢測(cè)。