發酵食品中羧甲基賴氨酸的研究進展

曹衛，徐陽鑫，賀婷，陳媛媛，馮年捷，吳茜*

(1.湖北工業大學 生物工程與食品學院，武漢 430068；2.工業發酵湖北省協同創新中心，武漢 430068；3.湖北省食品發酵工程技術研究中心，武漢 430068；4.湖北工業大學 材料與化學工程學院，武漢 430068)

發酵食品是指人們利用有益微生物加工制造的一類食品，常見的發酵食品主要有乳類發酵制品、谷物發酵制品和豆類發酵制品，并且它們的消耗量大，是人們經常食用的一類食品，其富含氨基酸、多肽、蛋白質、糖類等營養物質，對人體健康有很大的益處。但是，在發酵過程中很容易發生美拉德反應從而產生AGEs，如CML就是其中的一種，這些物質在人體內大量積累會對人體造成潛在的危害，因此，了解發酵食品中CML的形成和對其進行控制至關重要。

美拉德反應主要指食品中的氨基化合物與羰基化合物之間發生的復雜反應[1]，在非酶促條件下，還原糖(主要是葡萄糖)的醛基和蛋白質、氨基酸、脂類等大分子物質的游離氨基發生羰氨反應，經過脫水縮合、聚合、裂解、氧化修飾后產生一組穩定的AGEs[2]。食品中的AGEs主要通過美拉德反應和脂質氧化過程形成[3]，但是在發酵食品中也能夠發現一定量的AGEs。AGEs包含的種類很多，除了CML外，還含有羧乙基賴氨酸(Nε-(Carboxyethyl)lysine，CEL)和吡咯素等[4]。只有對AGEs這一類化合物形成的條件進行深入的研究，并找出相應條件影響其形成反應速率的規律，才能更加有效地控制其在發酵食品中的含量。

1 CML的介紹及測定方法

1.1 CML的介紹

在與美拉德反應相關的檢測AGEs的研究中，CML因為具有易標記、易檢測的特點，作為在食品加工過程中出現美拉德反應時體內還原糖氧化或者修飾蛋白，羰基化合物形成或脂質氧化的重要標記產物，所以食品體系中總AGEs含量的高低就由CML含量的高低來評價。CML廣泛存在于日常生活中，常見的如老抽、黃酒、豆豉等發酵食品中，被消化吸收后蓄積在肝臟、神經細胞、心肌等組織器官中，會導致一些疾病的發生。CML的化學結構式見圖1。

圖1 CML的化學結構式

形成CML的途徑非常復雜，有廣泛的底物來源，可作為形成CML的底物如蛋白質、還原糖、脂質和抗壞血酸等[5]。在發酵食品生產加工過程中CML很容易形成，它的形成是多種因素共同作用的結果，CML的形成不僅是單一的一條途徑，而且由不同途徑最終形成。

1.2 CML的測定方法

目前，CML的檢測方法有很多，主要有酶聯免疫法(ELISA)[6]、氣相色譜-質譜(GC-MS)法和超高效液相色譜-質譜(UPLC-MS)法。

1.2.1 酶聯免疫法(ELISA)

ELISA法是基于免疫學原理且在檢測AGEs方面應用已很廣泛，其基本原理主要是通過抗體(單克隆與多克隆)與待測物、固相抗原發生競爭結合反應來測定目標物含量。ELISA是一種快速、價廉、操作簡便的CML檢測方法，近年來，ELISA在食源性CML的檢測中得到逐步應用。Teresia等[7]采用ELISA法對500余種食品中的CML進行檢測，從檢測結果來看，食品自身的營養成分和食品制作時的加工工藝對AGEs的產生會有非常大的影響。發酵食品富含蛋白質等營養成分，在發酵過程中易形成CML；而且CML隨溫度的升高而升高，一些發酵食品在發酵過程中也會涉及到高溫的過程，在高溫過程中就會積累大量的CML。ELISA法雖然具有上述提到的操作方式簡便、花費時間少、成本低的優點，卻也有許多缺點，例如最終結果沒有標準的單位來反映；另外，ELISA法在檢測過程中每個化合物都需要有特異性抗體來競爭結合，并且檢測時樣品的基質會影響特異性檢測的結果，最終會導致CML含量的測定結果不夠精確。

1.2.2 氣相色譜-質譜(GC-MS)法

GC-MS法作為一種檢測食源性CML的儀器分析方法，具有高分辨率、高靈敏度、高效的優點；但同時也有許多缺點，在應用GC-MS法時，除需要對食品樣品進行繁瑣的前處理步驟外，還需對樣品進行衍生化處理，這些操作若沒有完成或者存在操作錯誤，都會導致最終結果的不準確性，但不得不承認GC-MS法在檢測CML的含量方面具有獨到之處。Charissou等[8]在檢測食源性CML的研究中，對食品樣品首先進行脫脂、酸水解處理得到游離態CML，而后對CML進行衍生化處理，即利用三氟乙酸酐衍生化CML上的氨基，利用甲醇在強酸條件下酯化CML上的羧基，最后用GC-MS法檢測衍生化后的CML，所測得的結果較為準確，此法比ELISA法的精確性高。

1.2.3 超高效液相色譜-質譜(UPLC-MS)法

如今，超高效液相色譜(UPLC)法也應用于檢測食品中的CML，與質譜儀聯用后，UPLC-MS法的靈敏度、選擇性和速度比高效液相色譜(HPLC)法優得多。所以，為了進一步提高精確性、選擇性和靈敏性，在檢測食品樣品中的CML時，UPLC與質譜儀串聯使用。檢測食品中CML含量的UPLC-MS法是由Assar等[9]創立的，運用此方法對許多食品樣品進行過檢測，應用廣泛。而且質譜儀的檢出限較低，加上監測的模式多，能同時定量分析體系中的不同種物質。

2 加工條件對發酵食品中羧甲基賴氨酸的影響

2.1 溫度對CML的影響

加熱溫度通過影響反應物的活性而影響CML的形成，在此基礎上，較高的溫度還能加快果糖降解的速率，從而產生更多的C2，C3活性碎片，而這些碎片較果糖有更高的反應活性，它們隨體系加熱溫度的升高而增加，造成CML的含量也隨之增多；因此，控制加熱溫度對于抑制CML的形成有重要作用[10]。

周建弟等[11]在研究中發現，溫度對美拉德反應的影響較大，一般溫度在30 ℃以上，其反應速度較快；若溫度相差10 ℃，其反應速度可相差3～5倍；而在20 ℃以下，溫度的波動則對美拉德反應的影響不太明顯。黃酒也是發酵產品的一種，在各個釀造階段的過程中，所需的溫度比較高，較高的溫度條件非常有利于加快美拉德反應的速率，從而形成較多的CML。孫佳賀等[12]在對白湯醬油儲藏期間褐變與美拉德反應的關系研究中發現，低溫儲藏能明顯抑制白湯醬油顏色變深，是因為低溫可以抑制美拉德反應形成CML。

2.2 pH對CML的影響

在CML反應體系中，pH對反應底物的活性影響很大，如賴氨酸的脫質子化、反應物果糖的開環式等活化形式會隨pH的升高而增強，從而使美拉德反應速率加快。劉春霞等研究發現，在CML反應體系中，酸堿條件會影響反應體系產生的自由基的活性，而實驗證實活性更強的自由基產生在堿性環境下，因此CML的形成在堿性條件下更容易。周燕瓊[13]在研究中發現，在果糖與賴氨酸體系中，隨著反應的進行，堿性賴氨酸的消耗導致pH降低，賴氨酸的脫質子化、反應物果糖的開環式等活化形式程度降低，減緩了反應速率。

劉曉庚等[14]在研究中發現，在弱酸性條件下有利于美拉德反應的進行，從而造成CML的積累，氨基酸和還原糖在強酸和強堿環境下分解速率加快，分解程度加深，而且強酸和強堿還會破壞美拉德反應生成的產物。周建弟等在研究中發現，酒體pH值對反應的影響表現在當糖類與氨基酸共存時，pH>3時，其反應速度隨pH值的升高而加快。魏桃英等[15]在研究中發現，美拉德反應可以在任何酸堿環境中包括中性條件下發生，但pH>3時，隨著pH的增加，反應速率會隨之增大；因此，在黃酒釀造過程中要確保pH在3.5～4.8之間，其原因是保證該酸性條件下對美拉德反應的促進作用。

2.3 時間對CML的影響

因為美拉德反應極其復雜，存在很多可逆反應，在一定的溫度條件下，隨著加熱時間的延長，CML含量先上升后基本不變，反應后期可逆反應達到平衡狀態。因此在食品熱加工過程中，盡量減少食品的加熱時間，減少食品的加工步驟，可有效減少食品中CML的含量，同時，要盡早食用加工好的成品。

魏桃英等研究發現，紹興黃酒在生產過程中，在一定條件下，溫度越高、時間越長，美拉德反應越強烈。例如在瓶裝酒殺菌過程中，由于反應底物充足，會進一步發生美拉德反應，加之這一過程持續時間比較長，反應更加劇烈。

3 羧甲基賴氨酸的控制方法

3.1 發酵食品中底物對CML形成的控制方法

3.1.1 反應底物中蛋白質對CML的控制

蛋白質作為形成CML的主要底物，在對食品熱處理的過程中，CML的形成會因其種類和數量的差別而產生較大的差異，尤其是不同種類的蛋白質對CML含量的影響尤為明顯，并通過實驗證明了在谷蛋白、酪蛋白、大豆蛋白和牛血清蛋白4種蛋白質中，形成CML的量會依次增高。當以丙氨酸、甲硫氨酸、蘇氨酸以及天冬氨酸等其他氨基酸作為反應底物時，實驗結果表明CML的形成量很低。但是作為形成CML的重要底物的賴氨酸，它對CML的形成具有決定性的作用，蛋白質含有的賴氨酸殘基數量決定了CML的生成量。

周建弟等在研究中發現，氨基類化合物包括蛋白質、肽類、胺、氨基酸等，在這些化合物中因含有還原性的氨基末端而易于和還原糖反應，其中胺類的相關反應速度是最快的；其次為氨基酸，在眾多氨基酸中，堿性氨基酸的反應比其他氨基酸的都要快；蛋白質由于其本身的氨基暴露的程度較小，它的反應速率比肽類和氨基酸都要慢。孫佳賀等在對白湯醬油儲藏期間褐變與美拉德反應的關系研究中發現，醬醪發酵過程中氨基酸對醬醪色澤影響的強弱次序為酸性氨基酸>中性氨基酸>堿性氨基酸。

3.1.2 反應底物中還原糖對CML的控制

大量的研究實驗證明，還原糖均可以與賴氨酸反應生成CML。Ruttkat等[16]建立了4種不同的還原糖與賴氨酸生成CML的模擬反應體系，經檢測發現，4種還原糖的模擬反應體系均能生成CML，而且在果糖、山梨糖、葡糖糖和半乳糖4種反應體系中形成CML的數量依次升高。Li等[17]建立了3種糖與賴氨酸生成CML的模擬反應體系，結果發現在蔗糖、葡萄糖和乳糖這3種反應體系中形成CML的量依次增大。但是 Sakai等[18]指出，果糖的糖基化能力比葡萄糖更強；Hinton等[19]的研究也表明，在葡萄糖-牛血清白蛋白體系中產生的CML含量要低于果糖-牛血清白蛋白體系。因此，是在果糖中生成的CML含量高還是在葡萄糖中生成的CML含量高，針對此研究結果目前還存在一些差異性，想要得到更確切的結果還需要進一步的研究。此外，Wu Qian等[20]研究發現，高糖環境能夠加速非酶糖基化和葡萄糖自氧化產生CML，抑制消化道中碳水化合物水解酶(α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶)的活性來延遲葡萄糖的吸收，從而抑制CML的形成。

莊名揚[21]在研究中發現，釀酒原料小麥、高粱、玉米等中的淀粉、纖維素在各類淀粉水解酶、纖維素酶等的作用下，生成各類單糖，反應速率為五碳糖>六碳糖，而六碳糖的反應速率則為半乳糖>甘露糖>葡萄糖。孫佳賀等在研究中發現，六碳糖的美拉德反應速度大概只有五碳糖的1/10。六碳糖相對于五碳糖來說碳鏈較長，所以碳架空間位阻效應大，因此其反應活性低，不利于反應的進行。總的來說，還原糖的還原性越大，反應活性越大，在同等條件下，越有利于CML的形成。所以，為了降低CML的含量，應采用還原性較小的糖類作為反應原料。

3.2 通過添加外源添加劑對CML的控制

研究表明，通過加入一些外源添加劑可以控制CML的形成。例如，檸檬酸是一種酸度調節劑，通常在食品的生產加工過程中，為了抑制CML的形成，可以通過添加適量的檸檬酸來調節食品體系的酸堿度。賴氨酸在堿性環境中會發生脫質子化反應形成具有更高反應活性的自由基，利于CML的生成；相反，酸性環境中會抑制賴氨酸變成具有較強反應活性的自由基，因此導致CML的形成受阻。

硼氫化鈉(NaBH4)是化學合成抗氧化劑中最常用的CML抑制劑，它之所以作為最常用的抑制劑是因為其具有很強的選擇性還原，它的分子結構中有4個呈-1價的H原子，可以將酮類、醛類和酰氯類等羰基化合物中的羰基選擇還原成羥基。NaBH4能夠通過還原CML的中間產物乙二醛(GO)和果糖賴氨酸(FL)來抑制CML的形成。付全意[22]對葡萄糖-賴氨酸模擬反應體系的研究發現，NaBH4不僅能夠還原CML的中間產物GO，而且還可以將形成CML的主要中間產物FL還原，終止其氧化裂解生成CML，從而抑制CML的形成。

部分天然抗氧化劑能夠有效抑制食品體系中CML的形成。付全意研究發現，黃酮類物質蘆丁對GO和FL生成CML以及葡萄糖向GO和FL的轉化均具有抑制作用。Zhang等[23]研究發現，多酚類化合物可通過結合CML的中間產物GO及清除自由基的方式對葡萄糖-酪蛋白模擬反應體系CML的形成發揮抑制作用。李曉明等[24]研究發現，蘆丁能夠有效抑制分別由活性二羰基化合物和還原糖引發的蛋白糖基化反應。孫濤等[25]研究發現，槲皮素對晚期糖基化產物表現出顯著的抑制作用，且抑制作用強于氨基胍。Peng等[26]從肉桂皮中提取得到了表兒茶素和原花青素B2，通過實驗證明這2種物質能夠有效抑制CML的生成，尤其是原花青素B2還可以通過捕獲CML形成過程中的中間產物GO從而阻斷CML的形成；在此之后，Peng等[27]又研究發現葡萄籽提取物富含的原花青素和兒茶素具有很強的抗氧化性，可以清除食品體系中CML生成的中間產物 GO。Wu Qian等[28]研究發現，蓮房原花青素(LSOPC)可以抑制美拉德反應中CML的形成。Shen Yixiao等[29]在研究中發現白藜蘆醇可以通過共軛反應抑制甲基乙二醛(MGO)，從而進一步抑制糖化反應；Wang Weixin等[30]研究發現，從山茶花中提取的植物化學物質通過清除甲基乙二醛抑制了高級糖化最終產物的形成。因此，在發酵食品的實際生產過程中，經常添加這些外源添加劑來控制CML的形成，從而保證產品的品質。

3.3 通過控制加工工藝條件控制CML的形成

加熱溫度、加熱時間、水分含量等加工條件對CML的形成有很重要和直接的影響，例如相同的食物原料經高溫、低濕加工產生的含量比低溫、高濕處理產生的CML含量高很多。因此，通過改善食品加工工藝條件可以更直接地達到對CML形成的抑制效果。實驗結果表明CML的含量雖然與加熱時間有一定的相關性，但是與加熱溫度之間是非線性關系，在堿性環境中更利于CML的生成，在高溫的加工條件下，會加劇CML的生成，因此，在實際生產過程中可以通過控制這些加工條件來控制發酵食品中CML的形成，主要的控制途徑有以下3個方面：一是降低食品加工溫度；二是縮短食品加工時間；三是減少食品加工步驟。

4 CML對人體產生的危害

CML在發酵食品中的危害主要體現在對人體健康的影響，其被人體攝入后，對人體會造成不可修復的慢性損傷。

從醫學界的研究中發現，AGEs可累積于人體不同的組織和器官中，當AGEs的累積量達到或超過一定閾值時，會誘發糖尿病[31,32]、尿毒癥[33]、阿爾茲海默癥[34]等，而且會使這些病情加重。而CML作為AGEs的典型代表物，同樣可以累積于人體內不同的組織和器官中，產生上述疾病，還有諸如腎衰竭(renal failure)、動脈粥樣硬化(atherosclerosis)[35]、慢性心力衰竭等。

這些研究表明控制發酵食品中CML的含量勢在必行，發酵食品是我國日常生活中不可或缺的食品，例如生活中常用的調味品老抽，其中的CML含量為游離態CML：(796.35±24.67) g/mL食品；結合態CML：(0.97±0.11) g/mL食品。這些發酵食品的攝入同時也造成我國居民對CML的攝入量增加，導致我國居民的健康水平下降，使人體慢性疾病的發病概率增大。

5 總結

發酵食品是我們日常生活中必不可少的食品，而其中美拉德反應所產生的AGEs是一直以來的熱門科研項目，CML作為AGEs的典型代表物更是被廣泛關注與研究。

經過多年的研究，CML的形成機理、對人體的危害性、控制方法都已經被逐步研究，而且檢測方法多種多樣，如ELISA法、GC-MS法和UPLC-MS法等，這些方法在操作復雜程度上、精度上、效率上都不盡相同，需要根據自己的需求來選取不同的檢測方法。

CML的形成機理較為復雜，CML的形成受到許多因素的綜合作用，比如熱加工處理方式、加熱時間、加熱溫度等。而通過研究發現，CML與許多疾病的發生密切相關，能促進多種疾病的發生。控制發酵食品中CML的含量可以從3個主要的方向進行：一是通過控制發酵食品中蛋白質的含量即CML的底物含量；二是可以通過添加一些有效的外源添加劑；三是可以通過控制加工工藝條件來控制CML的形成。對于發酵食品中CML的控制，還存在許多有待研究的方面，因為CML在發酵食品中的形成過程是一個動態平衡過程，現在的研究模型較為簡單，要建立更加有效的抑制途徑需要一個完善的模型。