流感病毒細(xì)胞分離培養(yǎng)陽(yáng)性檢出的主要影響因素分析

董 悅

第一個(gè)采取全球性監(jiān)測(cè)的傳染病就是流感，預(yù)防與控制流感的關(guān)鍵對(duì)策就是監(jiān)測(cè)流感，每年明確流感流行株、推薦分組疫苗、盡早發(fā)現(xiàn)變異株等，這些措施成為預(yù)測(cè)流感疫情的基礎(chǔ)性工作，而監(jiān)測(cè)流感的核心就是分離培養(yǎng)流感病毒[1]。本實(shí)驗(yàn)選擇醫(yī)院收集的流感樣病例的咽拭子中PCR檢測(cè)為陽(yáng)性的標(biāo)本作為實(shí)驗(yàn)的研究對(duì)象，實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果報(bào)道如下：

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象 選擇2016年11月-2017年12月朝陽(yáng)市1家國(guó)家級(jí)流感哨點(diǎn)醫(yī)院收集的流感樣病例的咽拭子中PCR檢測(cè)為陽(yáng)性的標(biāo)本作為實(shí)驗(yàn)的研究對(duì)象，標(biāo)本共計(jì)827份，從“中國(guó)流感監(jiān)測(cè)信息系統(tǒng)”提取流感病例（ILI）的基本特征與標(biāo)本實(shí)驗(yàn)室信息。

1.2 方法 根據(jù)試劑盒說(shuō)明書提取RNA與執(zhí)行PCR操作，反應(yīng)體系總體積參考值范圍24 μL:2×RT-PCR Buffer 12.6 μL，24×RT-PCR Enzyme Mix 1μL；上、下游引物參考標(biāo)準(zhǔn)都是0.6μL；探針參考標(biāo)準(zhǔn)為0.6μL；RNase Free Water參考標(biāo)準(zhǔn)是6μL；RNA模板參考標(biāo)準(zhǔn)是6μL。反應(yīng)條件參考條件：45 ℃條件下反轉(zhuǎn)錄10 min；95 ℃條件下預(yù)熱10 min；95 ℃條件下變性15 s；60 ℃條件下擴(kuò)增45 s；在45 ℃對(duì)單點(diǎn)熒光進(jìn)行測(cè)定，總共循環(huán)42個(gè)。測(cè)定實(shí)時(shí)熒光，會(huì)有標(biāo)準(zhǔn)S 型擴(kuò)增曲線產(chǎn)生，當(dāng)Ct值小于40，判定標(biāo)本呈陽(yáng)性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)所有數(shù)據(jù)全部由SPSS 19.0版統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料用（）表示，采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用以率（%）表示，采用卡方檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 標(biāo)本概況 827份陽(yáng)性標(biāo)本，男性525名，女性302名，男女比例為1.74:1，平均年齡（18.2±14.5）歲。流感流行時(shí)期（當(dāng)年10月－次年3月）標(biāo)本707份，非流感流行時(shí)期（當(dāng)年4月-9月）標(biāo)本120份；發(fā)病開(kāi)始到采集樣本的平均時(shí)間為（1.6±1.4）d，樣本采集到收集樣本時(shí)間間隔平均為（2.2±1.9）d，樣本收集到接種時(shí)間間隔中位數(shù)為9（3～18）d；21.5%（178/827）的樣本收集前保存在-70 ℃，78.5%的樣本在收集前保存在4 ℃。PCR檢測(cè)流感病毒陽(yáng)性標(biāo)本中，41.8%（346/827）屬于甲型流感病毒，58.2%（481/827）屬于乙型流感病毒。

2.2 分離病毒概況 從PCR陽(yáng)性標(biāo)本中498份分離結(jié)果呈陽(yáng)性，分離陽(yáng)性率為60.2%，其中25.1%（125/498）屬于季節(jié)性H3N2、42.6%（212/498）屬于新甲型H1N1、18.1%（90/498）屬于乙型（Victoria）、14.3%（71/498）屬于乙型（Yamagata）。

2.3 影響因素 經(jīng)logistic 回歸分析，性別、年齡、流行時(shí)期、采集樣本與收取樣本的時(shí)間、收集樣本前的保存手段、檢測(cè)結(jié)果等因素，都會(huì)對(duì)病毒分離結(jié)果產(chǎn)生一定影響，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），對(duì)比發(fā)病到采集樣本時(shí)間間隔與收集樣本到接種時(shí)間間隔等因素，對(duì)病毒分離結(jié)果的影響，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 logistic 回歸分析影響流感病毒分離結(jié)果因素

3 討 論

流感樣病例的發(fā)病時(shí)間不會(huì)影響流感病毒分離培養(yǎng)，流感病毒癥狀開(kāi)始的前1 d至病后5 d為流感病毒的排毒時(shí)間，通過(guò)癥狀學(xué)監(jiān)測(cè)流感，選擇有流感樣癥狀病例作為試驗(yàn)對(duì)象。影響流感病毒分離培養(yǎng)的重要因素是送樣本的時(shí)間，最佳送檢時(shí)間是48 h內(nèi)，送檢時(shí)間越早，陽(yáng)性率也就越高[2]。

RNA校正酶不會(huì)參與流感病毒的復(fù)制，所以RNA 聚合酶復(fù)制1萬(wàn)個(gè)左右核苷酸就有可能出現(xiàn)錯(cuò)誤；由于流感病毒基因組節(jié)段性，導(dǎo)致某一個(gè)細(xì)胞會(huì)同時(shí)被類型不同的病毒所感染，以致基因重配可能產(chǎn)生，因此，每年流感病毒都會(huì)產(chǎn)生變異，而變異導(dǎo)致每年流感強(qiáng)度不盡相同[3]。

實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，PCR核酸檢測(cè)陽(yáng)性標(biāo)本中，分離陽(yáng)性率為60.2%。分離病毒的最終效果取決于病毒自身的存活強(qiáng)度與病毒在細(xì)胞或雞胚腔中存活強(qiáng)度，所以病毒的存活率決定病毒分離的陽(yáng)性率，由此可知，影響分離培養(yǎng)病毒存活率的因素就是對(duì)病毒分離陽(yáng)性率帶去影響的因素[4]。研究結(jié)果表明，分離陽(yáng)性率不會(huì)受到病例的性別與年齡的因素的影響；由于普通人較易受流感病毒侵襲，所以不同人群有著相同的流感病毒的復(fù)制增殖的部位與方式。采集標(biāo)本與送檢樣本的過(guò)程中，不論什么季節(jié)，都需要選擇全程冷鏈運(yùn)輸?shù)姆绞剑圆煌餍屑竟?jié)不會(huì)太大影響到流感病毒的存活[5]。根據(jù)目前監(jiān)測(cè)流感方案，采集標(biāo)本后，需在4 ℃以下溫度保存；若不能保證于48 h內(nèi)把標(biāo)本送去檢測(cè)，就需在-70 ℃或以下溫度保存，之后于1周內(nèi)送去檢測(cè)。本次實(shí)驗(yàn)研究，采集的所有標(biāo)本都達(dá)到方案標(biāo)準(zhǔn)，當(dāng)流感病毒保存在合理溫度下，沒(méi)有通過(guò)反復(fù)的凍融，在短時(shí)間內(nèi)流感病毒的存活不會(huì)受到影響，所以收集樣本之前，無(wú)論標(biāo)本是保存在4 ℃還是-70 ℃的溫度下，亦或是采集樣本到收集樣本時(shí)間間隔等因素，都不會(huì)影響到分離陽(yáng)性率。本次實(shí)驗(yàn)研究證明，分析對(duì)比甲、乙型流感病毒的分離培養(yǎng)陽(yáng)性率，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

試驗(yàn)研究證明，發(fā)病開(kāi)始到采集樣本的時(shí)間、收集樣本到接種的時(shí)間，此兩種的間隔時(shí)間越短，病毒分離的陽(yáng)性率相對(duì)就會(huì)更高。相關(guān)實(shí)踐研究證明，機(jī)體感染流感病毒0.5～1 d時(shí)病毒排出達(dá)到最高值，平均排毒時(shí)間為5.0 d，感染流感病毒初期采集咽部標(biāo)本，一般存活的流感病毒都比較多[6]。根據(jù)試驗(yàn)條件、細(xì)胞培養(yǎng)周期，一般會(huì)在收集一定量流感病毒樣本后，再行病毒分離培養(yǎng)，低溫條件下流感病毒可以存活更長(zhǎng)時(shí)間，但如果過(guò)長(zhǎng)時(shí)間保存，會(huì)給細(xì)胞存活帶去影響，且多次凍融有可能降低病毒分離率。