LC—MS/MS法測定糧谷中除草劑氯氨吡啶酸及氨氯吡啶酸殘留量

張宏軍，吳進龍，朱文達，郭明程，吳鳳琪，王樓明，李 林

(1.農業農村部農藥檢定所，北京 100125；2.湖北省農業科學研究院植保土肥研究所，湖北 武漢 430064；3.深圳出入境檢驗檢疫局食品檢驗檢疫技術中心，廣東 深圳 51800)

氯氨吡啶酸(Aminopyralid)和氨氯吡啶酸(Picloram)屬于吡啶羧酸類的新型除草劑，廣泛用于山地、草原、作物田和非耕地等的雜草防除[1]，我國在GB 2763-2016[2]《食品安全國家標準 食品中農藥最大殘留限量》中規定：油菜籽中氨氯吡啶酸臨時管理限量為0.1mg/kg，谷物中氯氨吡啶酸的臨時管理限量為0.1mg/kg，歐盟[3]規定蔬菜、水果、糧谷類等氨氯吡啶酸及氯氨吡啶酸的最低限量均為0.01mg/kg，日本[4]對小麥、大麥、黑麥規定限量為0.01mg/kg。國際食品法典[5]規定了蔬菜、水果、谷物及肉制品中氯氨吡啶酸及氨氯吡啶酸的最大殘留限量分別為0.1～0.3 mg/kg。

目前關于氯氨吡啶酸及氨氯吡啶酸的測定方法主要是液相色譜-質譜/質譜法等。美國EPA[6]制定了氨氯吡啶酸的LC-MS/MS檢測方法，未有氯氨吡啶酸的檢測方法報道，該方法需要對氨氯吡啶酸進行衍生化，操作費時、繁瑣，且回收率和靈敏度偏低。其他國家包括我國尚未建立相關的檢測標準。

Ying Ying-Tian[7]等發表了有關氯氨吡啶酸及毒莠啶的LC-MS/MS檢測方法，該法采用C18色譜柱分離，負離子模式檢測，但由于氨氯吡啶酸及氯氨吡啶酸的極性較強，在傳統的反相色譜條件下保留時間太短。劉勇良[8]等建立了氨氯吡啶酸的高效液相色譜分析法，但該方法適用于主成分測定，測定低限為7.3%，不適用于殘留分析。孫星[9]等建立了氨氯吡啶酸的高效液相色譜-串聯質譜法，但該方法僅適用小麥和土壤中氨氯吡啶酸的殘留量，不能完全滿足法規的要求。

本文擬將改進的QuEChERS方法[10]應用于樣品前處理，采用LC-MS/MS測定食品中除草劑氨氯吡啶酸和氯氨吡啶酸殘留量。方法簡便、快速、準確、靈敏，且能滿足相關法規對食品中氨氯吡啶酸及氯氨吡啶酸殘留限量要求。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料 氨氯吡啶酸(Picloram)和氯氨吡啶酸(Aminopyralid)標準品均購自sigma公司，純度均>99.9%；實驗用甲醇、乙腈均為色譜純，購自Merck公司；甲酸為優級純，sigma公司提供；實驗用水為Mill—Q超純水；QuEChERS試劑購自上海安譜科技公司。

1.2 儀器 API 4500串聯質譜儀(美國AB公司)，配電噴霧電離源；IKA-T18勻漿機(德國IKA公司)；離心機(Allegra TMX-22R型，Beckman公司)；旋渦混合器(美國賽默飛公司)；氮吹濃縮儀(德國邦德公司)。

1.3 樣品前處理

1.3.1 提取 稱取試樣5.0g，精確至0.01 g，置于50mL離心管中，加入3 mL水，渦旋浸潤樣品后，加入10 mL 1%甲酸乙腈，28 000 rpm均質2min，再加入4g MgSO4、1g NaCl，漩渦振蕩10 min，9 500 rpm離心3 min。

1.3.2 凈化 取6mL上清液，加入預先加有150mg C18、900mg Na2SO4的15mL離心管中，漩渦振蕩3 min，9 500 rpm離心5 min。移取2mL上清液于15mL離心管中，40℃氮吹至近干，用10%甲醇水溶液定容至1mL，渦旋混合，過0.22μm有機濾膜，供LC-MS/MS測定。

1.4 儀器條件

1.4.1 色譜條件 色譜柱：Eclipse Plus C18Column，1.8μm，2.1×50mm；柱溫：30℃；進樣量：5μL；流動相：A：0.2%甲酸，2mmol/L 乙酸銨水溶液，B：甲醇；流速：0.3mL/min；梯度(表1)。

表1 液相色譜梯度洗脫條件

1.4.2 質譜條件 離子源：電噴霧電離(ESI+) ；毛細管電壓：3.0 kV；離子源溫度:110℃ ；脫溶劑溫度：350℃；氣簾氣壓力：25 psi；噴霧氣壓力：55 psi；輔助加熱氣壓力：55 psi；采用多反應監測(MRM) 模式。氨氯吡啶酸和氯氨吡啶酸的質譜采集參數(表2)。

表2 氨氯吡啶酸及氯氨吡啶酸的監測離子對

2 結果與討論

2.1 提取方法的選擇 氨氯吡啶酸、氯氨吡啶酸結構為吡啶環外加羧基、氨基及不同數量的氯原子，極性強，且酸性也強，其PKa=2.3左右，采用1 %甲酸-乙腈(v/v)提取，可抑制酸性農藥解離，有利于酸性農藥向乙腈相轉移，從而提高回收率。

聚類分析的結果能夠反應高頻關鍵詞間的親疏關系，揭示當期研究熱點[7]。從圖3聚類分析的部分結果可以看出，當前創客教育的主要研究內容如下。

以大米及小麥為基質，比較2種提取溶劑的提取效果即(1)1%乙酸-乙腈提取、無水硫酸鎂及乙酸鈉鹽析。(2)乙腈提取、無水硫酸鎂及氯化鈉鹽析，結果顯示回收率有顯著區別(表3)，故本實驗采用加乙酸鹽緩沖液的QuEChERS提取方法。

此外，為提高提取率，提取過程需要采用均質，為避免加入硫酸鎂產生結塊，加入酸化乙腈后就應立即均質，然后再加入無機鹽，再行振蕩。

2.2 分散吸附劑的選擇與用量 QuEChERS方法是美國農業部于2003 年開發，代表食品分析中樣品制備過程的快速、簡便、廉價、高效、耐用和安全。這項技術非常簡單，操作步驟少，對于復雜樣品的凈化非常有效。QuEChERS 技術多用來分析水果和蔬菜中的多類別、多殘留農藥，目前AOAC及歐盟均公布了官方QuEChERS標準，由于本次分析的目標物的極性和酸性均很強，傳統的固相分散萃取技術不適用于本標準，故擬對其進行改進，選取常用的凈化材料：C18，C18+GCB，C18+PSA，C18+PSA+GCB 4種凈化材料，以100μg/kg加標水平，平行測定6次，考核每種凈化材料條件下的待測物回收率(表4)。

表3 2種提取溶劑加標100μg/kg的回收率和相對標準偏差(n=6，RSD%)

表4 不同凈化材料下加標100μg/kg的回收率和相對標準偏差(n=6,RSD%)

由結果可知 C18和C18+GCB凈化效果較好，加入GCB回收率未有提高，但GCB對色素有很好的凈化效果，故對色素含量高的樣品選擇C18+GCB作為凈化材料，其他樣品選用C18作為凈化材料。

再考核C18的使用量。選取小麥及大米為基質，按照意見稿進行提取凈化，其中凈化劑C18分別加入50、100、150、200、250mg，GCB均加入50mg，平行測定6次，其他條件不變，測算氨氯吡啶酸及氯氨吡啶酸的回收率(表5)。

表5 不同劑量凈化材料下加標100μg/kg的回收率和相對標準偏差(n=6,RSD%)

結果表明C18用量為150 mg時凈化效果最佳，加大用量不能提高凈化效果，因此本文采用150 mg C18進行凈化。

2.3 定容液的選擇 由于待測物的極性較強，采用反相色譜對其分離時，需考察是否存在溶劑效應。定容液分別采用純乙腈和初始流動相(10%甲醇/水溶液)時，結果(圖1、圖2)。

圖1 純乙腈定容液TIC圖

圖2 流動相(10%甲醇/水溶液)定容液TIC圖

由圖1、2可知待測物在純有機相中存在較強的溶劑效應，故采用初始流動相(10%甲醇/水溶液)作為定容液。樣品提取液需經氮吹，溶劑置換成流動相后上機檢測，以減小測量誤差。

2.4 基質效應 LC-MS/MS定量分析存在基質效應，在方法驗證時應對基質效應進行評估。基質效應與基質的種類及基質干擾物的含量、分析物的特性、色譜分離條件、不同儀器離子源設計等有關，可按以下公式對基質效應進行量化評估：基質效應(ME，%)=[(基質匹配校準曲線斜率/純溶劑標準曲線斜率)-1]×100。|ME|<20%為弱基質效應，可忽略而無需采取補償措施；20 %≤|ME|≤50 %為中等程度基質效應，|ME|>50%為強基質效應，須采取措施補償基質效應。

按照1.3節進行前處理，配制基質匹配校準溶液，用流動相配制同濃度的純溶劑標準系列并制作校準曲線，按以上公式計算的ME結果。結果表明：糧谷基質中氨氯吡啶酸及氯氨吡啶酸的|ME|>20%，因此須采用基質匹配標準溶液進行定量校準以補償基質效應，確保定量結果準確。

2.5 線性范圍和測定低限 在0～100 μg/L范圍內配制濃度為5、10、20、50、100 μg/L的5組氨氯吡啶酸及氯氨吡啶酸系列標準溶液。以峰面積(y)為縱坐標，相應質量濃度(x，μg/L)為橫坐標，繪制標準校正曲線，經軟件分析可知，在0～100 μg/L范圍內，氨氯吡啶酸及氯氨吡啶酸在液相色譜串聯質譜儀上標準校正曲線的線性良好，相關系數均>0.999。

本方法的測定低限采用在不同基質中進行添加回收實際測定得到。氨氯吡啶酸和氯氨吡啶酸的測定低限均為0.01mg/kg，能滿足目前國內外所有食品中的限量要求，符合SN/T 0001-2016《出口食品、化妝品理化測定方法標準編寫的基本規定》和殘留分析質量控制指南對測定低限的要求。

2.6 方法精密度和回收率 本研究的室內回收率和精密度實驗，選用大米、小麥、蕎麥、小米、大豆、高粱等樣品基質，分別做3個不同水平的添加，添加量分別為10 、20 、100 μg/kg，4 ℃ 放置過夜，按建立的方法處理樣品，每個濃度水平進行6次重復試驗，測得的回收率和精密度(表6)。

表6 氨氯吡啶酸添加回收率及精密度試驗結果(n=6)

3 結論

本文根據實際工作的需求，建立了測定糧谷中除草劑中氯氨吡啶酸及氨氯吡啶酸殘留量的液相色譜串聯質譜法。本方法前處理簡單、靈敏度高、定量結果準確，本方法的測定低限為0.01 mg/kg，能夠滿足國內外現有法規要求，有很好的應用價值。