基于ERK-Calpain2通路探討黃連素對冠心病大鼠心肌細胞凋亡的影響*

朱 娜，曹雪明

（1．河南省人民醫(yī)院健康管理科，鄭州 450000；2．河南省人民醫(yī)院心內(nèi)科，鄭州 450000）

冠心病（CHD）近年來發(fā)病率逐年上升且日趨年輕化，它最直接的影響就是心肌缺血從而導致心臟的供氧減少，不能支持心臟正常工作，甚至導致部分心肌細胞凋亡[1-2]。研究報道，黃連素（BBR）可能通過促進抗氧化核轉(zhuǎn)錄因子Nrf2表達對H9c2心肌細胞缺氧/復氧損傷后的凋亡發(fā)揮顯著的抑制作用[3]。BBR可抑制細胞與調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）1/2途徑減輕大氣細顆粒物對EA．hy926內(nèi)皮細胞誘導的損傷凋亡[4]。這些提示黃連素對包括心肌細胞在內(nèi)的多種細胞凋亡具有抑制作用。但BBR在抑制心肌細胞凋亡中的機制還不完善。因此，本研究通過建立CHD大鼠模型，觀察BBR對模型動物心肌凋亡的作用，探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SD雄性大鼠30只，體質(zhì)量（200±20）g，常州卡文斯實驗動物有限公司，動物質(zhì)量合格證號：No．201722172。

1.2 試劑 BBR（國藥集團化學試劑有限公司），腦垂體后葉素（南京新百藥業(yè)有限公司），含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（Caspase）-3、Caspase-12、鈣蛋白酶（Calpain）2、鈣蛋白酶抑制蛋白（Capastatin）、葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（GRP78）、增強子結合蛋白同源蛋白（CHOP）抗體及羊抗兔和羊抗鼠IgG-HRP二抗（美國CST公司），GAPDH抗體（Bioworld公司），RIPA裂解液、BCA試劑盒（碧云天生物技術有限公司）,PrimeScriptTM RT reagent Kit、SYBR Premix Ex TaqTMⅡ熒光定量試劑盒及引物（大連TaKaRa公司）,一步法TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒（上海Beyotime公司）。

1.3 主要儀器 PIPETMANL微量可調(diào)加樣器，法國Gilson公司；Allegra 64R Centrifuge臺式高速冷凍離心機，美國Beckman Coulter公司；CKX41倒置顯微鏡，日本Olympus公司；MiniVE電泳設備，美國GE公司；ABI Prism 7300型熒光定量PCR儀，美國ABI公司。

1.4 動物模型的建立及分組給藥 參考文獻[5]方法每日給予高脂食物連續(xù)喂養(yǎng)6周，間隔24 h腹腔注射垂體后葉素30 μg/kg，連續(xù)3次，建立CHD大鼠模型，并測定模型鼠心臟ST段變化，與正常鼠相比，心臟ST段變化明顯升高的模型鼠為造模成功。將模型動物分為實驗組和對照組，根據(jù)預實驗結果，本研究實驗組予以80 mg/（kg·d）BBR灌胃；對照組每日予以等體積的雙蒸水灌胃。本實驗同時以正常SD大鼠設立空白組，予以等體積的雙蒸水灌胃。每組10只動物，治療周期為12周。

1.5 實時熒光定量聚合酶鏈式反應（RT-qPCR）法檢測心肌細胞中GRP78、CHOP、Calpain2 mRNA水平變化含量 采用大鼠的心肌組織，按照文獻[6]方法進行RNA提取、純化、RT反應和qPCR反應并計算分析實驗結果。

1.6 TUNEL染色檢測心肌細胞凋亡情況 參考文獻[7]將收集好的心肌組織石蠟包埋、切片、蘇木素染核，將切面放入Tris-HCl（含3%牛血清白蛋白和20%牛血清）中15～25℃浸泡，后經(jīng)磷酸緩沖鹽溶液（PBS）浸泡潤洗2次，晾干，在切片上滴加50 μL TUNEL 反應混合液，37℃孵育 1．5 h，PBS洗 3遍，稍微放干在倒置顯微鏡下觀察組織細胞凋亡情況，計算凋亡率，隨機選取5個非重疊400倍鏡視野，計錄凋亡心肌細胞數(shù)和心肌細胞總數(shù)，心肌細胞凋亡率=凋亡心肌細胞數(shù)/心肌細胞總數(shù)×100%。

1.7 蛋白免疫印記實驗分析各組大鼠相對蛋白表達量 大鼠的心肌組織參考文獻[8]的方法進行蛋白提取、SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜，及封閉。按需求加入 Caspase-12 抗體（1∶1 000）、CHOP 抗體（1∶2 000）、GRP78 抗體 （1∶2 000）、Calpain2 抗體 （1∶1 000）、Capastatin抗體（1∶1 000）及 GAPDH（內(nèi)參）抗體 4℃溫育過夜。次日，TBST洗膜3次，再加入相應的辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫雜交1 h，PVDF膜以化學發(fā)光試劑盒進行顯色，用Syngene Imaging System進行成像，用Image J對蛋白印跡條帶進行處理和分析。

1.8 統(tǒng)計學方法 采用Prism 7．0軟件對實驗結果進行統(tǒng)計學分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差s）表示。多樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較，方差齊時采用LSD法，方差不齊時采用Dunnett’s T3 法，P＜0．05 為具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組動物TUNEL染色結果 心肌TUNEL染色后對照組和實驗組均發(fā)現(xiàn)了不同程度的深棕色凋亡細胞，見圖1。與空白組相比，對照組細胞凋亡明顯，凋亡率（27．8±3．1）顯著增加（P＜0．01）；與對照組相比，實驗組細胞凋亡（18．7±2．2）顯著減少（P＜0．01）。

圖1 各組大鼠心肌TUNEL染色（×200）Fig.1 Myocardial TUNEL staining of rats in each group（×200）

2.2 各組動物Caspase-12、Caspase-3蛋白表達變化 與空白組相比，Caspase-12和Caspase-3蛋白均明顯上調(diào)（P＜0．01），而與對照組相比，實驗組上述蛋白均有不同程度下調(diào)（P＜0．01）。見圖2A和表1。

圖2 各組大鼠心肌Caspase-12、Caspase-3、GRP78和CHOP相對蛋白表達水平Fig.2 Elative protein expression levels of Caspase-12,Caspase-3,GRP78 and CHOP in myocardium of rats in each group

表1 各組大鼠心肌Cleaved caspase-12、Cleaved caspase-3、GRP78 和 CHOP 相對蛋白表達水平（Tab.1 Relative protein expression levels of Cleavedcaspase-12,leaved-caspase-3,GRP78 and CHOP in myocardium of rats in each group（%

表1 各組大鼠心肌Cleaved caspase-12、Cleaved caspase-3、GRP78 和 CHOP 相對蛋白表達水平（Tab.1 Relative protein expression levels of Cleavedcaspase-12,leaved-caspase-3,GRP78 and CHOP in myocardium of rats in each group（%

注：與空白組比較，*P＜0．01；與對照組比較，#P＜0．01。

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2.3 各組動物GRP78、CHOP、Calpain2 mRNA水平變化 與空白組相比，對照組GRP78、CHOP、Calpain2 mRNA 表達明顯升高（P＜0．01），而與對照組相比，實驗組動物GRP78、CHOP、Calpain2 mRNA表達下降（P＜0．05）。見圖 3。

圖3 各組大鼠心肌GRP78、CHOP和calpain2 mRNA表達水平Fig.3 Relative mRNA expression levels of GRP78,CHOP and Calpain2 in myocardium of rats in each group

2.4 各組動物GRP78、CHOP蛋白表達變化 與空白組相比，對照組GRP78和CHOP蛋白均明顯上調(diào)（P＜0．01）；與對照組相比，實驗組上述蛋白均有不同程度下調(diào)（P＜0．01）。見圖 2B 和表 2。

表2 各組大鼠心肌Calpain2、Calpastatin和p-ERK相對蛋白表達水平（Tab.2 Relative protein expression levels of Calpain2,Calpastatin and p-ERK in myocardium of rats in each group（%

表2 各組大鼠心肌Calpain2、Calpastatin和p-ERK相對蛋白表達水平（Tab.2 Relative protein expression levels of Calpain2,Calpastatin and p-ERK in myocardium of rats in each group（%

注：與空白組比較，*P＜0．01；與對照組比較，#P＜0．01。

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2.5 各組動物p-ERK、Calpain2和Capastatin蛋白表達變化 與空白組相比，對照組p-ERK和Calpain2 蛋白均明顯上調(diào)（P＜0．01），Capastatin 蛋白表達下降；而與對照組相比，實驗組p-ERK和Calpain2蛋白表達下調(diào)，Capastatin蛋白表達升高（P＜0．01），見圖 4 和表 2。

3 討論

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激（ERS）是凋亡的主要途徑之一，短期的ERS會導致抗凋亡的GRP78表達上調(diào)，而長期ERS會促進CAAT/CHOP以及胱天蛋白酶12剪切體（Cleaved-caspase-12）表達升高[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，CHD模型大鼠心肌Cleaved caspase-12、GRP78和CHOP表達升高，同時凋亡的執(zhí)行者Caspase-3剪切體（Cleaved caspase-3）增加。提示，模型動物心肌出現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激凋亡。研究表明，Calpain2為Caspase-12的上游信號分子[10]。本實驗發(fā)現(xiàn)模型大鼠Calpain2表達上調(diào)，而Calpastatin表達下調(diào)，提示Calpain2的表達和活性增強。近期研究發(fā)現(xiàn)，砷誘導的巨噬細胞凋亡伴隨著Calpain2的激活和ERK的磷酸化增強[11]。本研究發(fā)現(xiàn)模型動物p-ERK升高，Chen等[12]報道ERK為Calpain的上游信號靶點，p-ERK表達升高能提高Calpain活性，這些提示CHD大鼠心肌細胞可能通過ERK-Calpain2信號通路促進內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激凋亡。

圖4 各組大鼠心肌Calpain2、Calpastatin和p-ERK相對蛋白表達水平Fig.4 Relative protein expression levels of Calpain2,Calpastatin and p-ERK in myocardium of rats in each group

本研究實驗組以BBR灌胃治療后發(fā)現(xiàn)，模型動物心肌ERS標志物Cleaved caspase-12、GRP78和CHOP表達下降，凋亡執(zhí)行蛋白Cleaved caspase-3表達減弱。提示BBR能抑制CHD大鼠心肌發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激凋亡，而進一步實驗發(fā)現(xiàn)心肌Calpain2表達下調(diào)，Calpastatin上調(diào)，p-ERK蛋白下調(diào)，提示ERK-Calpain2信號轉(zhuǎn)導減弱。

綜上所述，BBR能抑制CHD大鼠心肌細胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激凋亡，該作用可能與抑制ERKCalpain2信號通路有關。