補(bǔ)腎開竅祛痰方對(duì)缺血性腦損傷大鼠海馬突觸可塑性的影響

杜福宏，宋良鵬，鄭徳偉

(日照市中醫(yī)醫(yī)院 神經(jīng)外科，山東 日照 276800)

腦卒中是嚴(yán)重危害人類健康和生命安全的常見難治性疾病，祖國(guó)醫(yī)學(xué)將其列為“風(fēng)、癆、臌、膈”四大疑難病之首，具有高發(fā)病率、高致殘率、高死亡率的特點(diǎn)[1]。其中，缺血性腦卒中約占卒中患者的75%左右，且易復(fù)發(fā)，給患者帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)壓力和心理負(fù)擔(dān)。目前，缺血性腦損傷發(fā)病機(jī)制研究主要集中在谷氨酸神經(jīng)毒性、氧自由基損傷、炎性增加和神經(jīng)元凋亡等[2]，而其中谷氨酸神經(jīng)毒性和神經(jīng)元凋亡均與神經(jīng)元突觸可塑性障礙有關(guān)。研究表明，海馬內(nèi)谷氨酸含量增加能導(dǎo)致突觸后膜離子型谷氨酸受體NMDAR異常活化，使神經(jīng)元軸突、樹突復(fù)雜性下降而影響學(xué)習(xí)記憶功能[3]；神經(jīng)元數(shù)量的缺失則會(huì)使突觸傳導(dǎo)功能減弱，影響大腦功能，進(jìn)而導(dǎo)致神經(jīng)精神疾病的發(fā)生[4]。補(bǔ)腎開竅祛痰方由《備急千金要方》中孔圣枕中丹加減而成，臨床研究證實(shí)能明顯改善腦卒中患者的運(yùn)動(dòng)能力及認(rèn)知功能，具有良好的神經(jīng)功能保護(hù)作用[5]，但其能否通過調(diào)節(jié)神經(jīng)突觸可塑性而緩解神經(jīng)損傷尚未有實(shí)驗(yàn)研究。因此，本實(shí)驗(yàn)擬以缺血性腦損傷模型大鼠為研究對(duì)象，以海馬突觸可塑性為切入點(diǎn)，通過檢測(cè)突觸結(jié)構(gòu)蛋白突觸素-1(Synapsin-1)、突觸后致密蛋白-95(PSD-95)和突觸功能蛋白鈣調(diào)蛋白激酶Ⅱ(CaMKII)、認(rèn)知缺陷突觸相關(guān)蛋白(SynGap)的表達(dá)情況，探討補(bǔ)腎開竅祛痰方的神經(jīng)保護(hù)作用及作用機(jī)制，為缺血性腦卒中的中醫(yī)藥防治提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物 補(bǔ)腎開竅祛痰方由熟地黃、鹿角膠、紫河車、菟絲子、益智仁、石菖蒲、升麻、全蝎等藥物組成，原藥材購(gòu)于河南省中醫(yī)院；依達(dá)拉奉注射液購(gòu)自吉林博大制藥公司，規(guī)格10 mL/15 mg，批號(hào)80-140712。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)健康雄性SD大鼠，50只，體質(zhì)量為180～220 g，由上海斯萊克動(dòng)物有限公司提供，生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK(滬)2017-0005。實(shí)驗(yàn)期間大鼠均飼養(yǎng)在室溫(24±2)℃、相對(duì)濕度(50±5)%、光/暗周期12 h/12 h的屏障環(huán)境中，自由攝食飲水。

1.3 試劑與主要儀器 兔抗大鼠Synapsin-1、PSD-95、GAPDH單克隆抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；兔抗鼠CaMKII、SynGap多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司；RIPA裂解液、BCA試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；DAB試劑盒、蘇木素購(gòu)自北京中杉金橋；山羊抗兔二抗購(gòu)自武漢博士德公司；Axio Imager光學(xué)顯微鏡購(gòu)自德國(guó)ZEISS；SpectraMax超微量核酸蛋白測(cè)定儀購(gòu)自英國(guó)BioDrop；MK3酶標(biāo)儀、RM2235手動(dòng)輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)購(gòu)自美國(guó)Thermo；Gel Doc XR+凝膠成像分析系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad。

1.4 動(dòng)物分組、造模與給藥 50只SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，根據(jù)體質(zhì)量值隨機(jī)分為2部分，其中10只為假手術(shù)組，另外40只進(jìn)行缺血性腦損傷模型制備。模型制備方法根據(jù)Longa線栓法[6]改進(jìn)，大鼠麻醉后，固定四肢，酒精消毒頸部，行頸部正中切口，分離右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈，尼龍魚線結(jié)扎頸外動(dòng)脈；在頸總動(dòng)脈近分叉處插入備用魚線，用鑷子輕輕將栓線送至大腦中動(dòng)脈起始處，平均進(jìn)線(18.0±2.0)mm。假手術(shù)組只游離血管，不插入尼龍線。造模完成后，去除死亡大鼠，其余大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分，根據(jù)評(píng)分情況將模型大鼠隨機(jī)分為4組，包括模型組、依達(dá)拉奉組、補(bǔ)腎開竅祛痰方低和高劑量組，每組10只。

分組完成后進(jìn)行給藥，依達(dá)拉奉組給予腹腔注射陽性藥依達(dá)拉奉(3.2 mg/kg)，同時(shí)灌胃蒸餾水；補(bǔ)腎開竅祛痰方低、高劑量組分別灌胃給予該復(fù)方臨床等效1、2倍劑量(8.4、16.8 g/kg)，同時(shí)腹腔注射生理鹽水；假手術(shù)組與模型組灌胃蒸餾水，同時(shí)腹腔注射生理鹽水。各組大鼠灌胃體積為10 mL/kg，腹腔注射體積為4 mL/kg，連續(xù)給藥7 d。末次給藥完成后1 h，再次對(duì)所有大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分，評(píng)分完成后麻醉大鼠，50%大鼠剝離海馬于液氮中保存，另外50%大鼠經(jīng)多聚甲醛灌注后取腦組織保存。

1.5 神經(jīng)功能缺損評(píng)分 參照Longa評(píng)分法對(duì)大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分，評(píng)分越高，神經(jīng)損傷越嚴(yán)重。具體為0分：無明顯損傷，1分：腦缺血對(duì)側(cè)前肢伸展不完全，2分：行走過程中轉(zhuǎn)圈，3分：行走過程中傾倒，4分：不能自發(fā)行走，意識(shí)喪失。

1.6 免疫組化法檢測(cè)海馬CA1區(qū)突觸結(jié)構(gòu)蛋白的表達(dá) 取固定于4%多聚甲醛溶液中的腦組織，石蠟包埋后切片，常規(guī)脫蠟，水化，滴加山羊血清封閉液，37 ℃孵育30 min，去除血清，加一抗(Synapsin-1，1∶100；PSD-95，1∶100)4℃孵育過夜；PBS洗3次，滴加HRP標(biāo)記的山羊抗兔50 μL，37 ℃孵育30 min，PBS洗3次，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水，透明，樹膠封片，顯微鏡下觀察。選取3個(gè)不同的視野，借助Image Pro軟件分析積分光密度值(integral optical density,IOD)。

1.7 Western blot法檢測(cè)海馬突觸可塑性功能蛋白的表達(dá) 取冷凍保存的海馬組織，稱重，加入3倍體積的RIPA裂解液，冰上勻漿，在4 ℃、12 000 rpm條件下離心15 min，取上清液，BCA試劑盒法測(cè)定總蛋白含量。制備分離膠和濃縮膠，蛋白上樣，SDS-PAGE凝膠電泳至溴酚藍(lán)跑出分離膠后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫下封閉1 h，根據(jù)目的蛋白分子量裁剪條帶，分別加入稀釋后的一抗(CaMKII，1∶500；SynGap，1∶1 000；GAPDH，1∶1 000)，4 ℃孵育過夜。次日用TBST液洗滌條帶4次，每次10 min，加入二抗室溫下孵育4 h，TBST液洗4次，每次10 min，之后進(jìn)行ECL顯影。應(yīng)用Image J軟件分析條帶灰度值，以GAPDH為內(nèi)參，根據(jù)目的蛋白和內(nèi)參蛋白對(duì)應(yīng)灰度值的比值計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分 假手術(shù)組大鼠無神經(jīng)功能缺陷癥狀，模型組大鼠行走時(shí)會(huì)表現(xiàn)出轉(zhuǎn)圈或向一側(cè)傾倒的現(xiàn)象，神經(jīng)功能缺損明顯，評(píng)分最高；與模型組比較，依達(dá)拉奉組和補(bǔ)腎開竅祛痰方高劑量組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分顯著下降(P<0.01)，同時(shí)補(bǔ)腎開竅祛痰方低劑量組也有較明顯的改善作用(P<0.05，見表1)。

組別神經(jīng)功能缺損評(píng)分給藥前給藥7 d后假手術(shù)0 0模型 3.05±0.543.15±0.67依達(dá)拉奉 3.08±0.511.54±0.37??##補(bǔ)腎開竅祛痰方低劑量 3.06±0.482.21±0.40?#補(bǔ)腎開竅祛痰方高劑量 3.06±0.521.92±0.34??##

與模型組比較，*：P<0.05，**：P<0.01；與給藥前比較，#：P<0.05，##：P<0.01。

2.2 各組大鼠海馬CA1區(qū)突觸結(jié)構(gòu)蛋白Synapsin-1、PSD-95表達(dá) 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元缺失明顯，細(xì)胞排列散亂，突觸前膜標(biāo)記蛋白Synapsin-1和突觸后膜標(biāo)記蛋白PSD-95陽性細(xì)胞數(shù)明顯變少，積分光密度值顯著減弱(P<0.01)；高劑量補(bǔ)腎開竅祛痰方干預(yù)后，大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元數(shù)量增加、排列趨于整齊，Synapsin-1、PSD-95積分光密度值顯著增強(qiáng)(P<0.01，見圖1～2、表2)。

A：假手術(shù)組；B：模型組；C：依達(dá)拉奉組；D：補(bǔ)腎開竅祛痰方低劑量組；E：補(bǔ)腎開竅祛痰方高劑量組。圖1 各組大鼠海馬CA1區(qū)Synapsin-1免疫組化染色結(jié)果(×400)

A：假手術(shù)組；B：模型組；C：依達(dá)拉奉組；D：補(bǔ)腎開竅祛痰方低劑量組；E：補(bǔ)腎開竅祛痰方高劑量組。圖2 各組大鼠海馬CA1區(qū)PSD-95免疫組化染色結(jié)果(×400)

組別Synapsin-1PSD-95假手術(shù)0.78± 0.110.81± 0.10模型0.43±0.06?? 0.41±0.07??依達(dá)拉奉0.71±0.09##0.68±0.08##補(bǔ)腎開竅祛痰方低劑量 0.59±0.07# 0.57±0.08補(bǔ)腎開竅祛痰方高劑量 0.68±0.10## 0.67±0.07##

與假手術(shù)組比較，**：P<0.01；與模型組比較，#：P<0.05，##：P<0.01。

2.3 各組大鼠海馬突觸可塑性功能蛋白CaMKII、SynGap表達(dá) 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠海馬突觸可塑性功能蛋白CaMKII、SynGap表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.01)；與模型組比較，依達(dá)拉奉組和補(bǔ)腎開竅祛痰方高劑量組大鼠海馬CaMKII、SynGap表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.01)，此外，低劑量的補(bǔ)腎開竅祛痰方能上調(diào)大鼠海馬CaMKII蛋白的表達(dá)(P<0.05，見圖3、表3)。

A：假手術(shù)組；B：模型組；C：依達(dá)拉奉組；D：補(bǔ)腎開竅祛痰方低劑量組；E：補(bǔ)腎開竅祛痰方高劑量組。圖3 各組大鼠海馬CaMKII、SynGap蛋白表達(dá)

組別CaMKIISynGap假手術(shù)0.51± 0.070.47± 0.07模型0.24±0.03?? 0.23±0.04??依達(dá)拉奉0.48±0.06##0.39±0.06##補(bǔ)腎開竅祛痰方低劑量 0.35±0.05#0.31±0.05補(bǔ)腎開竅祛痰方高劑量 0.41±0.06## 0.40±0.06##

與假手術(shù)組比較，**：P<0.01；與模型組比較，#：P<0.05，##：P<0.01。

3 討論

缺血性腦卒中屬中醫(yī)“中風(fēng)”、“卒中”范疇，其病機(jī)為因虛致瘀，瘀阻腦絡(luò)，與腎、心、腦有關(guān)，中醫(yī)防治當(dāng)以益氣化瘀、活血開竅為法則[7]。補(bǔ)腎開竅祛痰方是以《備急千金要方》中孔圣枕中丹為基礎(chǔ)方，經(jīng)化栽而得的臨床經(jīng)驗(yàn)方，全方共奏填精補(bǔ)髓、開竅祛痰、健腦益智之功效，在治療腦卒中、腦癱及其并發(fā)癥等疾病上療效顯著。本研究通過探明補(bǔ)腎開竅祛痰方對(duì)缺血性腦損傷大鼠海馬突觸可塑性的影響，闡述其減緩神經(jīng)損傷、保護(hù)腦組織的機(jī)制，對(duì)于該復(fù)方的進(jìn)一步開發(fā)具有重要意義。

突觸可塑性是指在外環(huán)境作用下，神經(jīng)元形態(tài)和功能發(fā)生較為持久的適應(yīng)性變化來維持神經(jīng)系統(tǒng)的相對(duì)穩(wěn)定，可分為結(jié)構(gòu)可塑性和功能可塑性。生理狀態(tài)下，神經(jīng)信號(hào)的傳遞依賴突觸前神經(jīng)元釋放的神經(jīng)遞質(zhì)與突觸后對(duì)應(yīng)受體結(jié)合，將信號(hào)逐一傳遞，發(fā)揮生理功能；而在病理狀態(tài)下，突觸可塑性障礙是導(dǎo)致認(rèn)知功能改變及多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)生的重要原因[8]。Synapsin-1和PSD-95分別是突觸前、后膜的標(biāo)記蛋白，Synapsin-1是一種突觸素，其表達(dá)水平?jīng)Q定了突觸的數(shù)量和密度；PSD-95是突觸后致密區(qū)核心構(gòu)架蛋白之一，能影響突觸連接的形成，反映突觸結(jié)構(gòu)的活性[9]。CaMKII是一種廣泛分布于海馬組織的多功能絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，被稱為記憶功能分子，主要表達(dá)于突觸后致密部位，具有Ca2+依賴性的自動(dòng)磷酸化特性[10]。SynGap是一種位于突觸的Ras GTP酶激活蛋白(Ras Gap)，在突觸興奮狀態(tài)下高表達(dá)，是CaMKII的主要催化底物[11]。CaMKII是Ca/CaM通路的下游信號(hào)分子，也是長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)(LTP)產(chǎn)生的關(guān)鍵信號(hào)，研究表明，神經(jīng)興奮傳遞至突觸后膜，Ca2+通道開放，Ca2+大量?jī)?nèi)流并進(jìn)一步激活CaM進(jìn)而引發(fā)CaMKII蛋白Thr286位點(diǎn)磷酸化，CaMKII活化后，催化SynGap，使其Ras GTP酶活性受到抑制，從而誘導(dǎo)LTP的發(fā)生，最終參與調(diào)節(jié)神經(jīng)元突觸可塑性及機(jī)體學(xué)習(xí)記憶過程[12-13]。

本研究采用免疫組化法檢測(cè)海馬關(guān)鍵區(qū)域CA1區(qū)突觸結(jié)構(gòu)蛋白Synapsin-1和PSD-95的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)腎開竅祛痰方能逆轉(zhuǎn)缺血性腦損傷模型大鼠突觸結(jié)構(gòu)蛋白的低表達(dá)水平，增強(qiáng)其免疫陽性；同時(shí)，檢測(cè)海馬組織突觸功能蛋白CaMKII和SynGap表達(dá)發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)腎開竅祛痰方能顯著上調(diào)模型大鼠突觸功能蛋白的表達(dá)。上述結(jié)果說明，補(bǔ)腎開竅祛痰方能通過調(diào)節(jié)海馬神經(jīng)元突觸結(jié)構(gòu)和功能蛋白的表達(dá)發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)腎開竅祛痰方能顯著改善缺血性腦損傷大鼠的神經(jīng)損傷情況，其作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)海馬突觸可塑性有關(guān)。本研究結(jié)果對(duì)于進(jìn)一步闡明缺血性腦卒中的發(fā)病機(jī)制以及篩選治療該疾病的復(fù)方中藥提供了理論依據(jù)，下一步擬進(jìn)行更深入的機(jī)制研究。