三峽庫區消落帶野生狗牙根對水淹適生性的轉錄組分析

李彥杰,劉仁華,周大祥,楊俊年,蔣夢蕓,吳 巍,郭世浩,高 鑫

1 重慶三峽學院教師教育學院,萬州 404100 2 重慶三峽學院生物與食品工程學院,萬州 404100

自三峽大壩175 m蓄水以來,從大壩到其上游重慶江津地區的長江兩岸形成了與天然河流漲落季節相反的干濕交替區域—三峽庫區消落帶[1-2]。環境的改變破壞了三峽庫區消落帶原有陸生植被生態系統多樣性,并隨之帶了如水土流失和農業面源污染加重等諸多問題[3-4]。三峽庫區消落帶生態環境治理的關鍵是恢復或重建消落帶植被生態系統。國內學者從消落帶植被調查和適生植物篩選入手,發現消落帶野生香根草(VetiveriazizanioidesL.)、空心蓮子草(AlternantheraPhiloxeroides(Mart.)Griseb.)和狗牙根(Cynodondactylon(Linn.)Pers.)等植物在三峽庫區消落帶反復地出露與淹沒交替過程中能保持較高存活率,并指出上述適生植物可通過形態學發育及生理、生化指標等變化以響應水淹信號,并在一定程度上對水淹環境表現出適生性[5- 9]。

狗牙根是三峽庫區消落帶原生植物,具有發達的根莖和匍匐枝,可固土護坡以防治水土流失。已有研究表明,狗牙根具有很強的環境適應性,可在水淹等非生物脅迫中維持較長存活時間,其主要適生性機制可能與其在脅迫環境中的氣生組織發育、提升細胞還原力及解毒能力等有關[10- 12]。水淹結束后,狗牙根也可耐受高氧環境而迅速恢復生長,因此在三峽庫區消落帶治理實踐中應用廣泛[13-14]。目前關于狗牙根對水淹生境的適生性研究多集中在生理、生化水平,而對其通過哪些信號通路響應水淹脅迫,并進一步對哪些基因的表達做出調整以適應水淹脅迫等研究未見報導。本研究以三峽庫區消落帶野生狗牙根為材料做水淹處理,通過轉錄組測序分析,研究狗牙根在水淹生境下的轉錄水平變化及差異表達基因,以期加深對狗牙根在水淹生境下適生性的理解,并為植物的耐淹研究和三峽庫區消落帶治理提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

實驗用野生狗牙根來自重慶市萬州區譚紹村的三峽庫區自然消落帶。選取長勢良好、均勻一致的當年生分蘗苗隨機分為未水淹對照組(A1)和30 cm沉水處理組(A2)。準備內徑為42 cm,高度為22 cm的塑料桶,桶底打孔,墊塑料紗窗后以譚紹村自然消落帶濕潤沙土裝填土層厚度至15 cm,分別將兩組樣品移栽至桶內。處理組于2017年5月在譚紹村自然消落帶江邊(107°87′ E,30°35′ N)作30 cm沉水處理。處理組水淹15 d后可觀察到狗牙根的形態學變化,同時取兩組狗牙根幼嫩莖,沖洗后用液氮冷凍,并立即轉移至實驗室作后續處理。

1.2 試驗方法

1.2.1 測序樣品的制備及測序

以Trizol法(RNAiso for Polysaccharide-rich Plant Tissue,TaKaRa)提取樣品的總RNA, Nanodrop分光光度計檢測樣品總RNA OD260/280在1.8—2.2之間,電泳檢測樣品總RNA無明顯降解且28 S條帶亮度高于18 S條帶1.5倍以上。用Oligo(dT)磁珠富集mRNA,加入打斷試劑在Thermomixer中將mRNA打斷成短片段,將打斷的mRNA反轉錄為雙鏈cDNA,末端修復后加A及測序接頭,然后進行片段大小選擇,構建文庫,基于Illumina HiSeq 4000平臺測序。

1.2.2 轉錄組數據分析

測序所得原始讀序(Raw Reads)經過濾后得到純凈讀序(Clean Reads),使用Trinity軟件通過序列重疊得到重疊群(Contigs),并進一步組裝成轉錄本(Transcripts),再使用Tgicl軟件進行聚類去冗余得到Unigene。

使用 Blast分別對Unigene作核酸序列數據庫(nucleotide sequence database, Nt)、非冗余蛋白庫(non-redundant protein sequence database, Nr)、蛋白質直系同源簇(cluster of orthologous groups of proteins, COG)、京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG)和瑞士蛋白質序列數據庫(Swiss protein sequence database, Swiss-Prot)注釋,使用Blast2GO軟件及Nr注釋結果作GO(gene ontology)注釋,使用InterProScan5軟件作InterPro注釋。按照Nr、Swiss-Prot、KEGG和COG數據庫優先順序,選擇Unigene的最佳比對片段作為該Unigene的編碼序列(coding sequence, CDS),未能注釋的Unigene使用ESTScan工具作進一步預測。使用 Bowtie2軟件將clean reads比對到Unigene,然后基于期望最大算法(RNA-Seq expression estimation by Expectation-Maximization, RSEM)計算各個樣品的基因表達水平。基于泊松分布法(PossionDis)作差異表達基因分析,篩選標準為對比組樣品間表達倍數(fold change)≥2和錯誤發現率(false discover rate, FDR)<0.001；對差異表達基因作GO和Pathway功能分類及富集分析,功能和通路顯著富集篩選標準均為FDR≤0.01。

1.2.3 實時熒光定量PCR分析

隨機挑選4個差異表達基因,通過PrimerQuest Tool在線程序設計擴增引物,并設置擴增長度為80—250 bp(表1)。以GAPDH基因作內參,按照Ultra SYBR Mix Kit(康為世紀公司)提供的操作流程作實時熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR, qRT-PCR)擴增。擴增平臺為CFX connect Q-PCR儀(Bio-Rad,美國),擴增反應程序為：95℃保持10 min；95 ℃保持15 s,60℃保持1 min,設置40次循環。

表1 實時定量 PCR 選用基因及其引物

2 結果與分析

2.1 測序結果的評估及組裝

A1和A2組的Total Raw Reads分別為90.69 Mb和89.06 Mb,過濾后A1和A2 的Clean Reads分別為73.89 Mb和73.55 Mb。A1和A2的Clean Reads經Trinity組裝分別產生200570和124076條轉錄本。A1和A2的轉錄本經Tgicl聚類去冗余分別得到128031和83363條Unigene,總Unigene數目為147256。

2.2 Unigene的功能注釋

分別基于Nr、Nt、Swiss-prot、KEGG、COG、Interpro和GO數據庫作總Unigene注釋,結果如表2。7個數據庫可解釋的Unigene數目為107263,占總Unigene數目的72.84%。Unigene可注釋到不同物種的數量由高到底依次為小米(Setariaitalica)、高粱(Sorghumbicolor)、玉米(Zeamays)和疫霉菌(Phytophthoranicotianae)。

按照Nr、Swiss-Prot、KEGG、COG的優先次序,得到94879條Unigene的CDS。未注釋的Unigene經ESTScan預測得到8135條Unigene參考注釋。

2.3 差異表達基因分析

如表3所示,與未水淹對照組(A1)相比,水淹處理組(A2)共發現有28844條差異表達基因(differentially expressed genes, DEG),其中11858條DEG上調表達,16986條DEG下調表達,上調表達變化倍數為1.18—14.03,下調表達變化倍數為1.45—11.52。DEG在Nr、Nt、Swiss-prot、KEGG、COG、Interpro和GO數據庫注釋數目分別為22160、25901、21413、22478、16063、18188和16439。

表2 Unigene功能注釋

Nr：非冗余蛋白庫 non-redundant protein sequence database；Nt：核酸序列數據庫 nucleotide sequence database；Swiss-Prot：瑞士蛋白質序列數據庫 Swiss protein sequence database；KEGG：京都基因與基因組百科全書 Kyoto encyclopedia of genes and genomes；COG：蛋白質直系同源簇 cluster of orthologous groups of proteins；InterPro：蛋白質家族、結構域和功能位點數據庫 integrated documentation resource for protein families, domains and functional sites；GO：基因本體數據庫 gene ontology database

表3 狗牙根響應水淹生境差異表達基因的數量及差異范圍

2.4 差異表達基因GO功能分析

GO分析可將DEGs分為生物過程(biological process)、細胞組分(cellular component)和分子功能(molecular function)三大功能類。由圖1可知,生物過程中的細胞過程、代謝過程、單生物過程、生物調節、刺激反應和定位等是水淹生境下DEGs富集較多的種類；細胞組分中的細胞、細胞組分、細胞器、生物膜、細胞器組分和高分子配合物等是DEGs富集最多的種類；分子功能中的催化活性、結合劑活性、轉運活性、結構分子活性、核酸結合轉錄因子活性、電子傳遞體活性和抗氧化活性等是DEGs富集最多的種類。通過GO分析可知,水淹生境下,狗牙根的代謝過程、調節過程、細胞及組分和抗氧化等途徑中的DEGs可能共同參與狗牙根對水淹脅迫的適生性響應。

2.5 差異表達基因Pathway 功能分析

KEGG數據庫將DEGs分為細胞過程(cellular processes)、環境信息處理(environmental information processing)、遺傳信息處理(genetic information processing)、代謝(metabolism)和生物體系統(organismal systems)。這些通路中的轉錄、翻譯、碳水化合物的代謝和環境適應等可能在狗牙根對水淹生境的適生性過程中發揮重要作用(圖2)。

KEGG通路富集共檢出103個信號通路參與狗牙根對水淹脅迫的響應。按照富集程度從大到小,前10個顯著富集的信號通路如表4,其中Q值表示富集程度,它是統計推斷所得P值經過FDR校正后的值,其值越小表示富集越顯著。富集結果顯示,狗牙根對水淹生境的響應及適生性由眾多信號路通共同參與,其作用方式可能包括活化抗病因子、調整物質代謝、上調光合效率、提升獲氧能力和提高還原力等。

2.6 實時熒光定量PCR驗證

為了評估轉錄組測序結果的可靠性,隨機挑選Unigene76585、Unigene78381、CL10569.Contig1和CL1401.Contig1等4個DEGs作qRT-PCR擴增。基因相對表達量F=2-△△Ct,其中△△Ct=(待測樣品的目的基因的Ct值-待測樣本的看家基因的Ct值)-(對照樣品的目的基因的Ct值-對照樣本的管家基因的Ct值),管家基因為GAPDH。以log2-ratio表示基于轉錄組和qRT-PCR檢測的基因表達量變化,其中log2-ratio=log2[處理組表達量/對照組表達量],設置3次重復。相關性分析結果顯示,兩種檢測方法的皮爾遜相關系數為0.8490,P<0.01,表明基于轉錄組分析DEGs的表達結果較為可靠(圖3)。

圖1 DEGs的GO功能分類Fig.1 GO functional classification of DEGs1：生物粘附 Biological adhesion；2：生物相 Biological phase；3：生物調控 Biological regulation；4：細胞殺傷 Cell killing;5：細胞組分的組織和生物合成 Cellular component organization or biogenesis;6：細胞過程 Cellular process;7：發育過程Developmental process;8：發育 Growth;9：免疫系統過程過程 Immune system process;10：定位 Localization;11：移動 Locomotion;12：代謝過程 Metabolic process;13：多機體過程 Multi-organism process;14：多細胞組織過程 Multicellular organismal process;15：生物過程的負調控 Negative regulation of biological process;16：生物過程的正調控 Positive regulation of biological process;17：生物過程調控 Regulation of biological process;18：再生 Reproduction;19：再生過程 Reproductive process;20：刺激應答 Response to stimulus;21：節律過程 Rhythmic process;22：信號 Signaling;23：單一的生物過程 Single-organism process;24：細胞 Cell;25：細胞連接 Cell junction;26：細胞部件 Cell part;27：細胞外外液 Extracellular matrix;28：細胞外外液組分 Extracellular matrix part;29：細胞間區域 Extracellular region;30：細胞間區域組分 Extracellular region part;31：高分子配合物 Macromolecular complex;32：膜 Membrane;33：膜組分 Membrane part;34：膜結合腔體 Membrane-enclosed lumen;35：核狀體 Nucleoid;36：細胞器 Organelle;37：細胞器組分 Organelle part;38：共質體 Symplast;39：病毒體 Virion;40：病毒體組分 Virion part;41：抗氧化活性 Antioxidant activity;42：結合劑活性 Binding;43：催化活性 Catalytic activity;44：通道調節因子活性 Channel regulator activity;45：電荷載體活性 Electron carrier activity;46：酶調節活性 Enzyme regulator activity;47：鳥嘌呤核苷酸交換因子活性 Guanyl-nucleotide exchange factor activity;48：金屬伴侶活性 Metallochaperone activity;49：分子感應器活性 Molecular transducer activity;50：核苷酸結合轉錄因子活性 Nucleic acid binding transcription factor activity;51：營養受體活性 Nutrient reservoir activity;52：蛋白結合轉錄因子活性 Protein binding transcription factor activity;53：蛋白標簽 Protein tag;54：受體活性 Receptor activity;55：結構分子活性 Structural molecule activity;56：轉運因子活性 Transporter activity

圖2 DEGs的KEGG功能分類Fig.2 KEGG functional classification of DEGs1：轉運和代謝 Transport and catabolism；2：膜轉運 Membrane transport；3：信號轉導 Signal transduction；4：折疊、分選和降解 Folding, sorting and degradation；5：復制和修復 Replication and repair；6：轉錄 Transcription；7：翻譯 Translation；8：氨基酸代謝 Amino acid metabolism；9：其他次生代謝產物的生物合成 Biosynthesis of other secondary metabolites；10：碳水化合物代謝 Carbohydrate metabolism；11：能量代謝 Energy metabolism；12：多聚糖生物合成與代謝 Glycan biosynthesis and metabolism；13：脂質代謝 Lipid metabolism；14：輔助因子和維生素代謝 Metabolism of cofactors and vitamins；15：其他氨基酸代謝 Metabolism of other amino acids；16：萜類和酮類化合物的代謝 Metabolism of terpenoids and polyketides；17：核苷酸代謝 Nucleotide metabolism；18：環境適應 Environmental adaptation

通路Pathway差異表達基因數目(占比/%)Number of DEGs (percentage/%)Q值Q-value通路編號Pathway ID植物-病原物互作Plant-pathogen interaction2272 (9.85)7.433673E-96ko04626RNA運輸RNA transport3067 (13.3)6.049174E-59ko03013mRNA監視mRNA surveillance pathway2601 (11.28)1.197697E-53ko03015光合作用Photosynthesis106 (0.46)1.081199E-09ko00195光合天線蛋白Photosynthesis-antenna proteins44 (0.19)1.158267E-09ko00196植物激素信號轉導Plant hormone signal transduction721 (3.13)7.461203E-09ko04075卟啉和葉綠素代謝Porphyrin and chlorophyll metabolism170 (0.74)2.952624E-08ko00860光合作用碳固定Carbon fixation in photosynthetic organisms336 (1.46)1.914865E-07ko00710核糖體Ribosome993 (4.31)1.623489E-06ko03010花青素生物合成Anthocyanin biosynthesis40 (0.17)6.075180E-06ko00942

圖3 轉錄組測序結果的實時定量PCR驗證Fig.3 Verification of RNA-seq by Real-time qRT-PCR

3 結論與討論

在水淹、干旱和鹽堿等非生物脅迫生境下,植物可通過調整轉錄和翻譯水平而在一定程度上表現出對環境的適應性。光線不足、缺氧或厭氧是深水淹脅迫中影響植物生長的兩種主要因素。光線不足使得植物的光合作用受阻,從而限制了植物生長所需能量和物質的累積。氧氣不足使得植物由有氧呼吸轉變為無氧呼吸,除了抑制呼吸鏈而降低能量產生外,其也可產生乙醇等不完全氧化產物從而誘發細胞毒性[15- 17]。植物對水淹的響應較為復雜,通常涉及多個信號通路—既包括對光合作用、物質代謝和抗氧化等過程的適生性調整,也包括不定根及其他通氣組織等形態的適生性發育[18- 21]。

本研究以篩選的三峽庫區消落帶適生狗牙根作水淹處理,通過轉錄組測序分析發現狗牙根在水淹環境下共有28844條差異表達基因(DEGs),其中11858條上調表達,16986條下調表達。GO功能分析顯示,水淹脅迫下狗牙根DEGs主要富集在生物調節、細胞成分組織或組分合成、核酸結合轉錄因子活性等方面,這些DEGs共同參與了植物對水淹的響應和適生性發育,從而維持植物個體存活。進一步KEGG富集分析顯示,狗牙根對水淹生境響應的DEGs來自103個信號通路,其中參與眾多信號通路的乙烯、氧氣和脫落酸(abscisic acid, ABA)等分子可能通過對碳水化合物代謝和適生性發育等過程中多個基因轉錄和翻譯水平的調整而實現植物對水淹生境的快速響應[22-23]。 RNA的成熟和從細胞核向細胞質轉運是蛋白質翻譯的基礎,KEGG富集顯示,RNA轉運(RNA transport)通路中外顯子拼接復合體(exon junction complex, EJC)和核轉運復合物(nuclear export complex, NEC)等途徑多個組分下調,即水淹生境降低了RNA的成熟及向細胞質轉運。RNA監視通路(RNA surveillance pathway)是檢測和降解異常mRNA的控制途徑,KEGG富集顯示,該通路中多個參與mRNA降解的組分水平上調。核糖體(Ribosome)信號通路涉及翻譯的起始識別、延伸和終止等過程,富集顯示,該通路中的延伸因子ET-Tu等組分水平下調倍數較大。由上述3種信號富集結果可知,狗牙根對水淹的響應和適生性總體表現為通過調整細胞核RNA轉錄、mRNA轉運、細胞質mRNA降解和翻譯等途徑中多個因子的水平從而下調細胞蛋白質合成,這與干旱、水淹等非生物脅迫中多種植物細胞內蛋白質水平調節類似[24- 27]。

提高從環境中獲取氧氣的能力,也是水淹生境下植物的適生性機制之一。KEGG富集顯示,植物細胞對水淹生境的適生性與植物激素信號轉導(plant hormone signal transduction)通路有關,該通路中的脅迫響應信號、通氣組織形成與關閉和組織發育等途徑中多個組分上調。水淹生境下,通氣組織的形成有利于提高植物從環境的獲氧能力而維持存活,但同時也使得細胞間結構變得松散而可能導致個體死亡[28-29]。富集顯示,植物-病原互作(plant-pathogen interaction)信號通路中活性氧類(reactive oxygen species, ROS)和一氧化氮(nitric oxide, NO)的分子水平變化可能均與細胞壁的加固有關,這是因為植物在水淹等非生物脅迫下產生的ROS通過氧化交聯作用加固細胞壁,或通過下調NO信號途徑中NO水平而誘導氣孔關閉以加固細胞壁[30- 33]。此外,植物在水淹生境可能發生生長性損傷,富集結果也顯示,植物-病原物互作途徑中多個抗病信號分子水平上調,推測這可能與狗牙根在水淹生境下受水體及水下土壤的微生物侵染而誘發對病原體的防御反應有關。

完全水淹生境下,光線不足使得光合作用受限,同時某些代謝氧化產物的累積也可能對光合器官產生毒性。富集發現,水淹生境下狗牙根通過上調光合作用(photosynthesis)、光合作用-天線蛋白(photosynthesis-antenna proteins)、卟啉與葉綠素代謝(porphyrin and chlorophyll metabolism)等3個信號通路中的抗氧化組分而保護光合器官。同時,水淹生境下狗牙根也上調了參與上述信號通路中的光合作用進程、光呼吸調控以及與天線蛋白、葉綠素合成有關的酶水平,這可能與提高光合效率及加速碳水化合物的累積有關[34- 36]。核酮糖- 1,5-二磷酸羧化酶(ribulose- 1,5-bisphosphate carboxylase, RuBisCO)在葉綠體中固定CO2而生成糖類,植物在水淹等非生物脅迫后通常會導致細胞內RuBisCO活性下降而引起脅迫傷害[37]。本實驗富集結果顯示,較淺水淹生境下狗牙根通過上調光合生物碳固定(carbon fixation in photosynthetic organisms)信號通路中RuBisCO水平而提高物質累積。植物細胞中的酶和非酶抗氧化組分也參與對非生物脅迫的氧化應激適應性,其中非酶抗氧化組分如花青素、黃酮和類黃酮類等次生代謝產物可參與多種非生物脅迫環境中細胞氧化產物的清除[38-39]。富集結果顯示,水淹生境下,狗牙根細胞花青素的合成(Anthocyanin biosynthesis)信號通路中多個合成酶的表達水平上調,提高了細胞內的天竺葵素類、矢車菊素類、芍藥花苷配基類花青素和丙二酰基紫蘇寧花色苷等水平,從而增加了狗牙根在水淹生境的氧化耐受性。

植物對水淹的響應和適生性是一個包含多個信號通路中的眾多基因共同參與、相互協調的復雜過程。本研究對前期篩選的三峽庫區消落帶野生狗牙根在水淹生境下的轉錄組信息作了挖掘分析,為后續篩選狗牙根耐水淹關鍵調控基因和功能基因提供參考。此外,轉錄組數據中還存在大量的未注釋序列,對其進一步的分析挖掘將有助于加深植物對水淹響應和適生性的理解。