三種土壤條件下紫莖澤蘭根際的酶活性及細菌群落狀況

劉 海,王玉書,焦玉潔,彭麗媛,郭明全,王 勇,陳玉藍,袁 玲,*

1 西南大學資源環境學院,重慶 400716 2 貴州省農業科學院農業科技信息研究所,貴陽 550006 3 四川省煙草公司涼山州公司,西昌 615000

紫莖澤蘭(Eupatoriumadenophorum)屬菊科澤蘭屬雜草,原產中美洲。20世紀40年代從中緬邊境傳入我國,現已遍布云南、貴州、四川、重慶和廣西等西南地區,并以每年30—60 km的速度向我國東部和北部蔓延[1]。目前,人們采用化學、生物、人工等多種方法防除紫莖澤蘭,但效果欠佳,難于有效遏制其蔓延[2- 5]。

土壤是植物生長的場所,二者之間相互作用和影響。根際土壤的理化生物學性質直接影響植物吸收水分、養分和生長發育；另一方面,根系生命活動深刻改變根際環境的物理、化學,尤其是微生物學性質。在紫莖澤蘭侵入過程中,土壤自生固氮菌、氨氧化細菌和真菌數量增加,氮磷有效性提高,有益于養分吸收[6- 9]。紫莖澤蘭根際還存在拮抗病原微生物的細菌群落,使其免患土傳病害[10]。因此,從土壤微生物的角度看,紫莖澤蘭存在自我促進的侵入機制[11]。但祖元剛等[12]報道,在紫莖澤蘭根際土壤中,真菌和細菌的數量顯著低于喜樹,其蔓延擴散不改變土壤真菌和細菌的多樣性。此外,紫莖澤蘭還通過根系分泌、植株殘體和降雨淋溶向土壤中大量釋放化感物質,如單萜類、倍半萜類、甾體類、三萜類、苯丙素類、黃酮類及各類衍生物等[13- 14]。其中,澤蘭酮、香葉醛、香茅醛、香豆素、乙酸龍腦酯和樟腦等含量較高,對微生物具有選擇毒性,導致土壤細菌數量減少,真菌和放線菌數量增加[15- 16]。盡管紫莖澤蘭分泌的部分化感毒物含有苯、奈、菲、蒽等多環芳烴,但假單胞菌(Pseudomonas)、反硝化產堿菌(Alcaligenesdenitrificans)、諾卡氏菌(Nocardia)、解環菌(Cycloclasticus)、多色節桿菌(Arthrobacterpolychromogenes)和乙酸鈣不動桿菌(Acinetobactercalcoaceticus)等土壤微生物能利用其中的碳、氮而使其降解,故對其生長和繁殖影響不大[17- 18]。由此可見,紫莖澤蘭入侵對土壤微生物的影響十分復雜,目前尚無定論。

微生物是土壤的重要組成部分,參與土壤有機質循環,養分轉化,結構形成、毒物降解等物理、化學和生物學過程,與土壤健康質量密切相關[19-21]。紫莖澤蘭殘體和根系分泌物進入土壤后,可能影響微生物繁殖、生長和新陳代謝,進而改變微生物數量、活性和群落結構。明確紫莖澤蘭對土壤微生物的影響有益于揭示其侵入機制,為有效防除紫莖澤蘭提供科學依據。四川省涼山州是紫莖澤蘭入侵的重災區,危害面積超過幅員面積的20%。試驗選擇當地的主要土壤-紅壤,黃壤和紫色土,采用常規與高通量測序技術,研究了紫莖澤蘭根際和非根際土壤(距離根系約20 cm)的酶活性和細菌群落結構。

1 材料與方法

1.1 研究區概況

研究地點位于四川省涼山州西昌市(27°47′—28°02′N,102°10′—102°16′E),屬亞熱帶高原印度洋季風氣候,年均日照2423.1 h,年均雨量1013.1 mm,5月中旬—10月中旬的降雨量約占全年的90%,年均蒸發量1945 mm。當地的主要土壤類型為紅壤、黃壤和紫色土,是涼山州紫莖澤蘭分布最廣和面積最大的地區之一。

1.2 樣地選擇及取樣

每年8月中旬是當地紫莖澤蘭生物量最大的時期。試驗于2016年8月中旬進行,分別選擇典型、具有代表性的紅壤、黃壤和紫色土(表1),分別在紫莖澤蘭生長茂盛、形成單優種群的每種土壤上,各選擇5個10—15 m2的樣地,在每個樣地內選5點用抖根法采集根際土壤,并在紫莖澤蘭群體外約20 cm處的空地選擇5點同步采集非根際土壤,充分混勻并揀除雜物,置于冰盒,迅速帶回實驗室測定微生物量碳氮,剩余土樣一分為二,一份風干過篩,備測土壤酶活性(過氧化氫酶、酸性磷酸酶、脲酶、蔗糖酶)；另一份-20℃保存,用于細菌高通量測序。

表1 紫莖澤蘭樣地的地理信息

1.3 測定方法

采用氯仿熏蒸-K2SO4浸提,重鉻酸鉀氧化法和靛酚藍比色法分別測定土壤微生物量碳、氮[22]。分別采用靛酚藍比色法、3,5-二硝基水楊酸比色法、磷酸苯二鈉法和高錳酸鉀滴定法測定脲酶、蔗糖酶、酸性磷酸酶和過氧化氫酶活性[17]。其中,過氧化氫酶活性用20 min每克土壤分解的過氧化氫(毫升)表示,脲酶、蔗糖酶及酸性磷酸酶活性則依次用24 h每克土壤產生的NH3-N、葡萄糖和酚(毫克)表示。

取-20℃保存的新鮮土樣,參照454高通量測序方法,用E.Z.N.A Soil DNA試劑盒(OMEGA,USA),提取土壤基因組,純化后用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA大小及片段完整性,NanoDrop2000檢測DNA純度,TBS- 380檢測DNA濃度。用ABI GeneAmp? 9700型 PCR 儀,擴增細菌16S rDNA V3—V4區,引物為338F (5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA- 3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT- 3′)。PCR反應體系：FastPfu緩沖液4.0 μL、dNTPs(2.5 mmol/L)2.0 μL、引物(5 μmol/L)各0.8 μL、FastPfu聚合酶0.4 μL、BSA 0.2 μL、模板DNA10 ng、補ddH2O至20 μL。PCR擴增程序：95℃預變性3 min；95℃變性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸30 s,共28個循環,72℃終延伸10 min結束。每個樣品重復3次,將同一樣品的PCR產物混合后用2%瓊脂糖凝膠再次電泳檢測,用AxyPrepDNA 凝膠回收試劑盒(AXYGEN,USA)切膠回收PCR產物,并用QuantiFluorTM-ST藍色熒光定量系統定量檢測?；蚪M測序在上海美吉生物科技有限公司進行,測序平臺為454 GS-FLX(454 Life Sciences/Roche Diagnostics,CT,USA)。測序結束后,對有效序列進行去雜、修剪、去除嵌合體序列等過濾處理,得到優化序列。利用Usearch(vsesion 7.1)軟件對優化序列進行聚類分析,根據序列97%的相似性形成操作分類單元(Operational taxonomic units,OUTs),對比GenBank(http://ncbi.nlm.nih. gov)中的已知序列,得到OTUs的分類學信息[23]。

1.4 數據處理

試驗數據用Excel 2007和SPSS 19.0軟件進行計算和統計分析,采用配對t檢驗法對根際和非根際土之間的微生物量碳、氮含量進行差異性檢驗(P<0.05)。利用16S rDNA序列數計算細菌群落豐富度[24]。

豐富度指數：

R=Ni/N

式中,N為序列總數,Ni為細菌i的16S rDNA讀數。

2 結果與分析

2.1 土壤酶活性

由表2可知,在紫莖澤蘭根際,土壤酶活性顯著高于非根際(黃壤和紫色土的過氧化氫酶,以及紫色土的脲酶除外,其增幅未達顯著水平),依次增加2.74%—62.84%(過氧化氫酶)、7.66%—439.68%(磷酸酶)、2.69%—92.73%(脲酶)和89.18%—562.68%(蔗糖酶)。

表2 紫莖澤蘭根際和非根際土壤的酶活性

表中數據為平均值±標準差(n=5);*表示根際與非根際間差異達到5%顯著水平(t檢驗)

2.2 土壤微生物量

配對t檢驗表明,在紫莖澤蘭根際,微生物量碳氮顯著高于非根際(紅壤微生物量氮除外,其增幅未達顯著水平),微生物量碳分別高于非根際39.60%(紅壤)、47.47%(黃壤)和26.71%(紫色土)；微生物量氮分別高于非根際18.51%(紅壤)、48.13%(黃壤)和59.77%(紫色土)(圖1)。

圖1 紫莖澤蘭土壤中的微生物量碳、氮Fig.1 Microbial biomass carbon and nitrogen in soil with E. adenophorum *表示根際與非根際間差異達到5%顯著水平,t 檢驗

2.3 土壤細菌

2.3.1 序列數和分類單元數

由表3可見,454高通量測序從3種土壤中獲得21284—39974條16S rDNA序列,分別代表820—1222個分類單元。配對t檢驗表明,紅壤非根際序列數顯著高于根際,紫色土根際序列數顯著高于非根際,而黃壤根際與非根際相似；紅壤根際細菌分類單元數顯著低于非根際,黃壤和紫色土根際與非根際相似。

表3 紫莖澤蘭根際和非根際16S rDNA序列數和分類單元數

表中數據為平均值±標準差(n=5);*表示根際與非根際間差異達到5%顯著水平(t檢驗)

2.3.2 主成分分析

圖2 土壤細菌群落的主成分變異Fig.2 Principal components variation of soil bacterial community

圖2是土壤細菌群落的主成分變異情況。其中,PC1和PC2分別表示土壤細菌群落41.37%和34.47%的變異度。在紅壤和黃壤中,根際細菌群落的主成分方差和在PC軸上的得分系數與非根際差異顯著,其坐標點處于不同位置,相距較遠；而紫色土則相反,根際細菌群落的主成分方差和在PC軸上的得分系數與非根際無顯著差異,其坐標點相距較近。

2.3.3 細菌門類

由圖3可見,在紫莖澤蘭根際和非根際,細菌種群歸屬于放線菌門(Actinobacteria)、變形菌門(Proteobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)、酸桿菌門(Acidobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和藍藻門(Cyanobacteria)等16個門類。其中,放線菌門、變形菌門和擬桿菌門合占總量的60.69%—78.75%。

在根際和非根際之間,細菌門類的豐富度因土壤類型和細菌門類不同而異。從前3種優勢門類看,紅壤的優勢細菌依次為放線菌門、擬桿菌門和變形菌門,根際放線菌門的豐富度與非根際相似,變形菌門根際低于非根際,但擬桿菌門則相反；黃壤的優勢細菌依次為放線菌門、變形菌門和綠彎菌門,根際放線菌門的豐富度與非根際相似,變形菌門根際低于非根際,但綠彎菌門顯著高于非根際；紫色土根際的優勢細菌依次為變形菌門、擬桿菌門和放線菌門,非根際的則是變形菌門、擬桿菌門和酸桿菌門,其中變形菌門顯著高于擬桿菌門,且二者非根際的豐富度均高于根際。

圖3 紫莖澤蘭根際和非根際土壤中的細菌門類及豐富度Fig.3 Bacterial phyla and abundances in rhizosphere and non-rhizosphere soil of E. adenophorum

2.3.4 優勢類群

由表4可見,在紫莖澤蘭根際和非根際土壤中,前20種優勢細菌的豐富度合計占細菌總量的17.40%—36.57%。在不同土壤之間,20種優勢細菌中僅鏈霉菌1(Streptomyces1)為紫莖澤蘭根際的共有細菌,綠彎菌(Chloroflexi KD4- 96)為非根際共有細菌。在紅壤中,紫莖澤蘭根際和非根際有11種相同的細菌,它們是黃桿菌1(Flavobacterium1)、黃桿菌2(Flavobacterium2)、黃桿菌3(Flavobacterium3)、慢生根瘤菌(Bradyrhizobium)、芽生球菌(Blastococcus)、節桿菌(Arthrobacter)、鏈霉菌1、不可培養鞘脂單胞菌(unculturedKaistobactesp.)、不可培養紅色桿菌(uncultured Solirubrobacterales)、不可培養間孢囊菌(uncultured Intrasporangiaceae)和小單孢菌2(Micromonosporaceae 2)。其中,黃桿菌1、黃桿菌3、黃桿菌2、不可培養鞘脂單胞菌、芽生球菌和不可培養間孢囊菌在根際的豐富度依次高于非根際6.24、4.48、4.41、1.43、1.38、1.11倍；而小單孢菌2、節桿菌、不可培養紅色桿菌、慢生根瘤菌和鏈霉菌在根際的豐富度則不同程度地低于非根際。在黃壤中,紫莖澤蘭根際和非根際有8種相同的細菌,分別為慢生根瘤菌、鏈霉菌1、節桿菌、不可培養鞘脂單胞菌、不可培養生絲微菌(uncultured Hyphomicrobiaceae)、綠彎菌、不可培養間孢囊菌和類諾卡氏菌1(Marmoricola1)。其中,慢生根瘤菌、鏈霉菌1、不可培養生絲微菌和不可培養鞘脂單胞菌在根際的豐富度分別高非根際3.46、1.76、1.58、1.30倍；而綠彎菌、不可培養間孢囊菌、類諾卡氏菌1和節桿菌在根際的豐富度顯著低于非根際。在紫色土中,紫莖澤蘭根際與非根際有10種相同細菌,依次為不可培養噬纖維菌(uncultured Cytophagaceae)、不可培養待鑒定菌Latescibacteria、變形菌(Proteobacteria)、不可培養浮霉菌(uncultured Planctomycetes)、綠彎菌、不可培養產堿菌(uncultured Alcaligenaceae)、黃桿菌2、叢毛單胞菌(Comamonadaceae)、黃桿菌(FlavobacteriumenshienseDK69)和黃桿菌3。其中,變形菌和不可培養浮霉菌在根際的豐富度分別高于非根際1.45—1.05倍；但是,不可培養噬纖維菌和不可培養待鑒定菌Latescibacteria在根際和非根際的豐富度無顯著差異,其余菌屬(種)的豐富度根際低于非根際。

3 討論

土壤酶催化土壤生物化學反應,與土壤養分轉化供應密切相關[17]。脲酶水解尿素,提高土壤氮素的生物有效性；蔗糖酶參與蔗糖降解,關系到土壤有機質礦化；磷酸酶催化有機磷水解,供植物吸收；過氧化氫酶促進過氧化氫分解,涉及到土壤解毒過程[25]。盡管土壤類型不同,但在紫莖澤蘭根際土壤中,上述土壤酶的活性顯著高于非根際,類似李會娜等和戴蓮等的研究結果[26- 27],說明在紫莖澤蘭根際,有機質轉化活躍,氮磷有效性較高,有益于增加土壤養分供應,促進植物生長,提高紫莖澤蘭生存競爭能力。此外,紫莖澤蘭根際的微生物量碳氮顯著高于非根際,意味著紫莖澤蘭根系生命活動促進微生物生長繁殖,數量增加,活性增強,與李會娜等的研究結果相似[28],但不同于Sun等的報道[29]。土壤酶來源于有機肥、動物、植物和微生物等,其中微生物是土壤酶的重要來源之一[30- 31]。因此,在本項研究中,紫莖澤蘭根際微生物量提高,可增加酶分泌量,增強土壤酶活性。

表4 在紫莖澤蘭根際與非根際土壤中,前20種優勢細菌的組成與豐富度

紅壤根際的16S rDNA分類單元數顯著低于非根際,黃壤和紫色土的根際與非根際相似；主成分分析表明,在紅壤和黃壤根際土壤中,細菌群落的主成分方差和在PC軸上的得分系數與非根際差異顯著,其坐標點處于不同位置,而紫色土根際和非根際則相反。說明紫莖澤蘭對根際細菌種群數量和結構的影響因土壤類型不同而異,對紅壤和黃壤細菌群落結構的影響較大,但對紫色土的影響較小。眾所周知,土壤類型不同,微生物種群結構也不一樣[32]。微生物種類不同,對各類化學物質如抗菌素、重金屬等的敏感性和抗性也存在顯著差異[33- 34]。例如,水稻細菌性條斑病菌[35]、枯草桿菌[36]對鏈霉素敏感,但交替單胞菌[37]、酪酸梭菌[38]的敏感性較差；貧營養細菌[39]、費氏弧菌[40]對重金屬敏感,但弗蘭克氏菌[41]、慢生根瘤菌[42]的敏感性差。紫莖澤蘭根系分泌的化感物質內含苯、奈、菲、蒽等多環芳烴等結構,故對根際細菌群落結構的影響表現出土壤類型間的差異和多樣性,由此解釋了前人有關報道不盡相同的原因[8, 10, 15],深入研究紫莖澤蘭侵入與不同土壤細菌群落演變的生理生態學意義很有必要。此外,盡管紅壤、黃壤和紫色土的細菌群落不同,但紫莖澤蘭表現出極強的適應性,均可旺盛生長,排除其他植物,形成單優種群。

在不同類型土壤之間,優勢菌株的群落結構的差異極大。在根際的20種優勢細菌中,僅鏈霉菌1(Streptomyces1)相同,在非根際只有綠彎菌(Chloroflexi KD4- 96)為共有菌株,意味著紫莖澤蘭具有極強的適應性,能在細菌群落結構不同的土壤上生長。但就同一種土壤而言,紫莖澤蘭根際和非根際細菌的優勢門類均為放線菌、變形菌和擬桿菌,合計占總量的60.69%—78.75%；在前20種優勢細菌中,根際和非根際之間有8—11株相同,也表現出較高的相似性。說明土壤可能是決定根際微生物種群的重要因素,但因紫莖澤蘭根系生命活動而發生不同程度地變化。此外,放線菌門、變形菌門和擬桿菌門中,很多微生物參與土壤有機質礦化,具有分解纖維素、半纖維素、蛋白質和木質素等功能[43],加之當地氣候屬于溫暖濕潤的亞熱帶氣候,這可能是供試紅壤、黃壤和紫色土有機質含量較低的重要原因之一。

總之,在紫莖澤蘭根際,土壤酶活性及微生物量碳氮含量顯著高于非根際；紫莖澤蘭能在細菌群落結構不同的土壤上生長,表現出極強的適應性,對根際細菌群落結構的影響因土壤類型不同而異；土壤是決定細菌群落的主要因素,但紫莖澤蘭侵入會導致其發生一定程度的變化。