干熱河谷土壤酶活性對碳氮添加的響應

樊 博,史亮濤,潘志賢,何光熊,孫 毅,閆幫國,*

1 云南省農業科學院熱區生態農業研究所,元謀 651300 2 元謀干熱河谷植物園,元謀 651300

碳氮是生態系統運轉的關鍵元素[1-2]。碳氮交互作用深刻地影響生態系統的功能以及生態系統對全球變化的響應[3]。二氧化碳濃度升高可以促進植物生長,從而可以固定更多的碳,但是這種促進作用與氮元素的豐缺有關[4]。當氮逐漸限制時,二氧化碳濃度對植物生長不再具有促進作用[5]。

大氣二氧化碳濃度升高和溫度增高對植物生長的促進作用增加了土壤的碳輸入[6]。另一方面,日益增加的大氣氮沉降增加了土壤氮的含量,導致碳可能會成為土壤生物化學過程的限制養分。因此,碳氮交互作用同樣可能存在于土壤生態系統中。碳是許多生態系統中限制土壤微生物生長的因素,特別是氮添加下的生態系統中,碳的限制可能更為嚴重[7]。

土壤酶是影響土壤養分循環和有機物分解的重要催化物質,主要由土壤微生物分泌而來[8]。土壤酶活性反映了土壤的肥力[9],其化學計量學特征反映了土壤養分的平衡狀況[10]。碳氮平衡的改變必然對土壤酶活性及其化學計量學特征產生重要影響。

土壤酶是促進土壤穩定有機碳形成的重要因素[11]。碳源物質的水解酶產物被微生物利用后更容易與土壤礦物質結合,進而形成穩定的土壤有機碳[12]。然而,外源碳輸入并不一定伴隨土壤碳庫的增加。外源碳可能會激發土壤中有機質的分解,產生激發效應(Priming effect)[13]。事實上,隨著植物生產力的提高和碳輸入的增加,土壤碳庫的分解速率也在增加,從而抵消了碳的輸入[14]。相反,氮增加可能會促進土壤穩定有機碳的形成[15]。這些截然不同的結果可能與碳氮對土壤酶活性的影響有關。因此,認識碳氮對土壤酶活性的交互作用是了解全球變化下土壤生態系統功能和生物地球化學循環變化趨勢的關鍵。

已有研究表明碳、氮交互作用對生態系統生產力具有重要的影響[5],那么碳、氮對土壤酶活性的影響是否存在交互作用？本研究依托干熱河谷的實驗草地,進行土壤碳氮添加控制實驗,揭示碳氮交互作用對土壤酶活性的影響。研究結果將有助于進一步認識碳氮在土壤生態系統中的作用及其耦合機制,理解生態系統富氮化后碳氮平衡對土壤酶活性的影響機制。

1 材料和方法

1.1 實驗地概況

實驗地位于金沙江干熱河谷地區的元謀溝蝕崩塌觀測站上,年均溫在21℃左右,年降水量低于700 mm,且90%以上分布在雨季(6—10月)。當地的優勢植物為黃茅Heteropogoncontortus、孔穎草Bothriochloapertusa、擬金茅Eulaliopsisbinata和橘草Cymbopogongoeringii等。區域內土壤侵蝕較為嚴重,導致部分地表的植被破壞和土層混合。為了模擬土壤侵蝕狀況下植被恢復對土壤生態系統的影響,選定一個土壤類型為燥紅土的實驗區,去除植被和表層土壤(0—100 cm),通過推土機混合后回填部分土壤。土壤全碳含量為2.55 mg/g,全氮含量為0.20 mg/g,全磷含量為0.10 mg/g,pH為6.26左右。整個實驗區被劃分為12個區塊,區塊面積8 m×16 m。每個區塊劃分為8個樣方,各樣方中配置了不同的植物物種[16]。每個樣方面積為1.8 m×1.8 m。中間間隔0.4 m,區塊之間間隔1 m。

為了探明氮添加對土壤生態系統的影響,6個區塊每年添加固體分析純NH4NO3,分兩次分別在6月和8月中旬添加,添加量為每年5 g N m-2(大約為區域大氣沉降背景值[17]的2—3倍左右)。氮添加通常選擇在連陰雨期間進行,氮添加時與少量當地沙土混勻后播撒。另外6個區塊為對照,只播撒相應量的沙土。氮添加區塊與對照區塊隨機排列,以消除位置上土壤異質性的影響。處理區塊間隔0.8 m,設置土埂。該樣地2012年建成,2013年開始進行氮添加處理。

2015年10月采集了4種單一種植樣方下(分別為黃茅、孔穎草、擬金茅和橘草)的表層土壤 (0—15 cm)。每個物種的處理包含10個樣方,其中5個為對照；5個為氮添加。實驗共含有4個植物處理×2個氮處理×5個重復=40個樣方。

1.2 樣品處理與測定

每個樣方的土壤稱量2份(100 g風干土壤樣品),放入350 mL Mason瓶中,其中一份為對照,第二份添加碳,為500 mg C kg-1土壤(0.1251 g葡萄糖/100 g土壤)。所有土壤樣品水分含量均調節至田間飽和含水量的60%,用封口膜蓋住以降低水分流失,每隔3 d校正一次水分。28℃下暗培養,9天后(預實驗表明碳添加9 d后土壤酶活性趨于穩定,與Allison和Vitousek[20]的研究結果相似)將土壤取出,置于4℃冰箱中保存,用于測定土壤酶活性。

根據Sinsabaugh等研究結果[21],土壤或沉積物中C、N、P水解酶可由β- 1,4-葡萄糖苷酶(BG),酸性磷酸酶(AP),幾丁質酶(NAG)和亮氨酸氨基肽(LAP)表征,具體測定方法參照[22]。β- 1,4-葡萄糖苷酶、酸性磷酸酶和幾丁質酶測定方法相似,底物分別為對硝基苯-β-吡喃葡萄糖苷、對硝基苯磷酸二鈉和對硝基苯β-N-乙酰葡糖胺糖苷,用pH 5.0的50 mmol/L醋酸緩沖液配制濃度為2.5 mmol/L的底物溶液(由于對硝基苯β-N-乙酰葡糖胺糖苷極難溶解,底物溶液的濃度為1 mmol/L)。在測定土壤酶活性前將土壤充分混勻。預實驗表明土壤太多,反應底物不足會限制反應速率；土壤太少,反應產物顯色太弱。因此本研究進行了預實驗來測定不同土壤重量下酶活性的倍性關系和重復性,以確定合適的土壤量(AP為0.15 g左右；LAP 0.35 g左右；NAG 0.2 g左右；BG 0.2 g左右)。測定的具體步驟是：稱量土壤并記錄重量,放入10 mL離心管中,再加入4 mL底物溶液；用4 mL緩沖液加土壤作為土壤對照；同時設置底物對照(不加土壤)。20℃培養結束3—4 h后離心3 min。提取上清液2.5 mL,加入0.25 mL 1 mol/L NaOH終止反應和顯色,在410 nm處測定吸光度,用不同濃度對硝基酚作為標準曲線。亮氨酸氨基肽酶測定中采用L-亮氨酸- 4-硝基苯胺作為底物,以pH為8.0的50 mmol/L Tris緩沖液配制1 mmol/L的底物溶液。在10 mL離心管中加入0.1 g左右的新鮮土壤,加入4 mL 1 mmol/L的底物溶液；同時設置底物對照和土壤對照,所有樣品培養4 h。由于該底物對氫氧化鈉很敏感,極易分解,另外pH 8.0緩沖液已經可以使對硝基酚顯色,因此本指標是培養結束后直接在分光光度計410 nm處測定吸光度。定量方法也是用不同濃度對硝基酚作為標準曲線。酶活性為樣品測定值減去土壤對照和底物對照,用nmol對硝基酚 g-1h-1表示。

1.3 數據分析

初步分析后發現植物物種與碳或氮之間均不存在顯著的交互作用。因此本文將不同物種處理合并,只關注碳氮的作用及其交互作用。土壤酶C∶N化學計量學特征用ln(BG)∶ln(LAP+NAG)表征；C∶P用ln(BG)∶ln(AP)；N∶P用ln(LAP+NAG)∶ln(AP)表征[21]。用最小顯著差異法(LSD)比較碳氮處理間的差異；采用方差分析法分析碳氮處理及其交互作用對土壤酶活性的影響。為了揭示碳氮添加對土壤土壤酶活性變化的關聯性影響,計算了土壤酶活性在碳添加后的變化值(碳添加后土壤酶活性減去沒有碳添加的對應值),并采用線性回歸分析法分析碳添加后酶活性變化值與土壤初始有效氮含量之間的關系。

2 結果與分析

2.1 碳氮處理對土壤酶活性的影響

氮添加顯著增加了土壤中有效氮含量,使有效氮含量平均值由4.47 mg/kg增加至11.67 mg/kg。施氮處理顯著影響了土壤AP和LAP活性(表1)。氮添加下AP活性由542.63 nmol g-1h-1增加至1143.77 nmol g-1h-1；LAP活性則由29.60 nmol g-1h-1降至24.14 nmol g-1h-1,降低了18.4%；碳添加顯著影響了AP、LAP和NAG活性,三者分別由407.20、21.92、20.56 nmol g-1h-1增加至1279.19、31.82和31.59 nmol g-1h-1,分別增加了214.1%、45.2%和53.7% (圖1)。

圖1 碳氮添加下土壤酶活性(平均值±標準誤)Fig.1 Soil enzyme activities (Mean±SE) under carbon and nitrogen additionsBG, β- 1,4-葡萄糖苷酶β- 1,4-glucosidase; NAG, 幾丁質酶Chitinase;LAP亮氨酸胺肽酶Leucine aminopeptidase; AP, 酸性磷酸酶Acid phosphatase; 不同字母表示組間存在顯著差異

碳氮交互作用顯著影響了BG、AP和LAP活性 (表1)。在對照樣方的土壤中,碳添加使BG活性由63.01 nmol g-1h-1降至43.24 nmol g-1h-1,降低了31.4%；在施氮樣方的土壤中,碳添加使BG活性由48.09 nmol g-1h-1增加至74.27 nmol g-1h-1,增加了54.4%。對照樣方中,碳添加AP和LAP活性影響較小,碳添加使AP活性為由358.88 nmol g-1h-1增加至726.38 nmol g-1h-1,使LAP活性由25.88 nmol g-1h-1增加至33.32 nmol g-1h-1,二者分別增加了102.4%和28.8%；而施氮樣方的土壤中,碳添加下AP活性由455.53 nmol g-1h-1增加至1832.01 nmol g-1h-1,LAP活性由17.96 nmol g-1h-1增加為30.32 nmol g-1h-1,分別增加了302.2%和68.8% (圖1)。回歸分析表明,碳添加下AP和BG酶活性增加值與土壤初始有效氮含量顯著正相關 (圖2),其他酶活性增加值與土壤初始有效氮含量不相關。

圖2 碳添加下土壤酶活性變化與土壤初始有效氮含量之間的關系Fig.2 Relationships between changes in soil enzyme activities and soil initial nitrogen availabilities under carbon additions

2.2 碳氮處理對C∶N∶P土壤酶化學計量學特征的影響

施氮處理顯著降影響了土壤C∶P和N∶P水解酶化學計量關系 (表1)。氮添加下ln(BG)∶ln(AP)和ln(LAP+NAG)∶ln(AP)顯著下降,分別由0.62和0.63降低為0.59和0.56。碳添加顯著影響了C∶N和C∶P的水解酶化學計量關系(表1)。碳添加顯著降低了ln(BG)∶ln(LAP+NAG)和ln(BG)∶ln(AP),使其分別由1.07和0.65降低為0.97和0.56 (圖3)。

表1 碳(C)、氮(N)及其交互作用對土壤酶活性的影響

BG, β- 1,4-葡萄糖苷酶β- 1,4-glucosidase; NAG, 幾丁質酶Chitinase;LAP亮氨酸胺肽酶Leucine aminopeptidase; AP, 酸性磷酸酶Acid phosphatase

圖3 碳氮添加下土壤酶化學計量學特征(平均值±標準誤)
Fig.3 Soil enzymatic stoichiometry under carbon and nitrogen additions (Mean±SE)

碳氮交互作用顯著影響了C∶N和C∶P的水解酶化學計量關系 (表1)。在對照樣方中碳添加使ln(BG)∶ln(LAP+NAG)由1.08降低為0.90,降低了16.9%；ln(BG)∶ln(AP)由0.69降低至0.56,降低了19.9%；而在施氮樣方土壤中,碳添加下ln(BG)∶ln(LAP+NAG)由1.06降低為1.04,僅降低了1.9%；ln(BG)∶ln(AP)由0.60降低為0.57,僅降低了5.8% (圖3)。

3 討論

3.1 碳對土壤酶活性的限制

本研究發現,碳對土壤酸性磷酸酶、幾丁質酶和亮氨酸胺肽酶活性具有較大的促進作用,表明碳是干熱河谷土壤酶活性的限制因素。碳可以為土壤微生物的土壤酶合成提供能量,同時碳也是構成土壤酶的關鍵元素[8]。干熱河谷植物生產力較低,土壤中有機質較為缺乏,導致土壤中可供微生物利用的碳不足,這在氮添加后可能顯得更為突出。土壤酶活性是土壤養分循環的重要驅動力[10],也是土壤肥力的重要指標。碳對土壤酶活性的限制也可能存在其他生態系統中。全球范圍的綜合數據顯示,根際土壤的土壤酶活性總體上可以比非根際土壤高出28%[23],根際土中的土壤酶活性增強的現象可能與根系分泌的碳化合物有關。事實上,植物根際土壤酶活性與根系的碳分泌量顯著正相關[24],表明碳對多數生態系統中的土壤酶活性都可能具有限制作用。

3.2 碳氮交互作用對土壤酶活性的影響

碳氮交互作用表明碳對部分土壤酶活性的影響與氮有關。當碳氮添加后,土壤中的磷的限制作用日益突出,土壤微生物為了獲取更多的磷從而合成酸性磷酸酶,促進磷從有機物中釋放。這就表明植物根系分泌物或者植物枯落物對土壤酶活性的促進作用可能與氮含量有關。而另一方面,植物根系通過吸收土壤氮,造成根系周圍氮的缺乏,這可能會影響根系分泌物對部分土壤酶活性的促進作用。相反,豐富的氮含量則可以加速磷的循環[25]。在氮沉降下,土壤中的氮含量不斷增加,這將改變根際土壤的酶活性及其化學計量學特征,從而對植物養分吸收和土壤碳氮磷循環產生深遠影響。

碳氮交互作用同樣存在于β- 1,4-葡萄糖苷酶和亮氨酸胺肽酶,碳添加對這些土壤酶活性的促進作用主要發生在氮添加土壤中。β- 1,4-葡萄糖苷酶是水解纖維素的酶[10],可以為微生物提供必需的碳水化合物。本研究中添加葡萄糖使得碳對微生物生長的限制作用降低,從而降低了β- 1,4-葡萄糖苷酶活性。但是,在氮添加樣方中,微生物對碳的需求仍然較大,促使微生物繼續合成β- 1,4-葡萄糖苷酶。此外,碳添加還可能緩解了土壤對微生物生長的限制因素[7],極大地增加了氮添加土壤中的微生物量,導致β- 1,4-葡萄糖苷酶活性增高。

氮添加降低了亮氨酸胺肽酶活性,這與微生物分配的經濟理論[26]相符。亮氨酸胺肽酶是氮循環的關鍵酶,可以降有機態氮分解,從而為植物和微生物提供可利用的無機態氮。氮添加以后,土壤中的無機態氮含量逐漸升高,氮元素不再是限制養分,因此可能造成土壤微生物對氮循環的酶合成下降。然而,碳添加對亮氨酸氨肽酶活性的促進作用與土壤初始氮含量并無顯著關聯,表明其他因素可能影響了碳添加的效應,比如土壤pH[27]。

已有的研究表明氮添加對土壤酶活性的影響存在很大的不確定性,存在正效應、負效應、或者沒有作用[28]。氮添加對不同生態系統土壤酶活性的影響存在很大不同[29],這是否與不同生態系統的土壤碳限制程度有關呢？本文的研究結果表明：碳氮交互作用決定了土壤酶活性。碳源充足的土壤中亮氨酸胺肽酶活性不受氮添加的影響,而β- 1,4-葡萄糖苷酶和酸性磷酸酶活性則會受到氮添加的促進；而在碳源不足的環境中,氮添加則會降低亮氨酸胺肽酶活性,而對β- 1,4-葡萄糖苷酶和酸性磷酸酶活性的促進作用較小或者沒有促進作用。此外,碳氮交互作用可能也是有機肥對土壤酶活性促進作用大于化學肥料[30- 32]的原因,畢竟有機肥含有大量的碳源物質。因此,以后的研究應當關注碳氮交互作用對土壤酶活性的影響。

由于碳、氮對不同酶活性影響的差異,導致了土壤碳氮磷水解酶化學計量學特征的變化。總體上碳添加降低了C∶N和C∶P的水解酶活性比,氮添加增加了C∶N的水解酶活性比,但是降低了N∶P的水解酶活性比,這與微生物分配的經濟學理論相一致[26],即微生物傾向于分泌相關的酶來水解更為稀缺的養分。

4 結論

碳氮交互作用顯著影響了干熱河谷土壤的酸性磷酸酶、β- 1,4-葡萄糖苷酶和亮氨酸胺肽酶活性。碳添加對土壤酸性磷酸酶和β- 1,4-葡萄糖苷酶活性的促進作用與土壤氮含量有關。碳氮交互作用對土壤酶化學計量學特征也具有顯著影響,碳添加雖然降低了對照樣方C∶N和C∶P的水解酶活性比,但是在氮添加樣方的土壤中這種效應不再顯著,表明碳氮交互作用可能會影響該地區土壤碳氮磷循環的平衡。土壤酶化學計量學特征反映了土壤中的養分平衡,是影響土壤生物地球化學過程的關鍵驅動因素。碳氮交互作用的影響,表明在研究和認識生物地球化學循環中,需要更多維的角度,注重多元養分的交互作用。