四倍體楸葉泡桐的誘導(dǎo)及鑒定

張變莉 王楊 劉榮寧 范國強

摘要：將預(yù)培養(yǎng)不同時間的楸葉泡桐組培苗葉片分別放置到含有不同濃度秋水仙素的液體MS+NA AO.3 mg/L+B A 140 mg/L培養(yǎng)基上進行了染色體加倍試驗，分析了變異植株倍性。結(jié)果表明：外植體接受秋水仙素處理的時間對葉片存活率、芽誘導(dǎo)和四倍體誘導(dǎo)率的影響極顯著;秋水仙素的處理濃度對葉片存活率、芽誘導(dǎo)率的影響極顯著，但其對四倍體的誘導(dǎo)卻為顯著影響;外植體預(yù)培養(yǎng)時間對芽誘導(dǎo)率和葉片存活率的影響達到顯著水平。在27個試驗組合中，用30 mg/L秋水仙素處理預(yù)培養(yǎng)6d白花泡桐葉片48 h時，四倍體誘導(dǎo)率最高可達5.83%。誘導(dǎo)出的植株葉片大而厚，氣孔密度減小，單個氣孔器變大。

關(guān)鍵詞：葉片;楸葉泡桐;秋水仙素;四倍體

中圖分類號：S792. 43

文獻標(biāo)識碼：A

之章編號：1674-9944（2019）24-0059-04

1 引言

泡桐因其生長迅速，材質(zhì)優(yōu)良，是造紙、建筑、家具、樂器等重要用材樹種之一。其樹姿優(yōu)美，花色艷麗，有較強的抗大氣污染能力，也是我國重要的園林綠化樹種之一。然而，在泡桐生產(chǎn)中也出現(xiàn)了叢枝病頻發(fā)、干低冠大等問題，嚴(yán)重影響了其推廣應(yīng)用。

植物多倍體具有植株具有生物量大，抗逆能力強等優(yōu)點，這極大增強了植物的觀賞特性和商業(yè)價值[1-3]。近年來，范國強等成功對白花泡桐、臺灣泡桐等進行了四倍體的誘導(dǎo)[4-6]，創(chuàng)制了新的泡桐種質(zhì)資源，培育了泡桐新品種。本文采用不同濃度秋水仙素對楸葉泡桐（P.catalpifolia）葉片進行培養(yǎng)，研究其同源四倍體的誘導(dǎo)技術(shù)。

2 材料與方法

2.1 材料及處理

材料具體消毒處理方法參見張變莉等[7，8]的方法。將采集于河南農(nóng)業(yè)大學(xué)林業(yè)試驗站的楸葉泡桐種子，先用酒精和HgCI2分別進行消毒處理，再用無菌水沖洗、晾干后放置到不含植物激素的MS培養(yǎng)基上，在人工氣候培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。80 d后，剪取同一株楸葉泡桐組培茁頂部的2片葉子放在其器官直接發(fā)生的培養(yǎng)基[9]上增殖，而后取其葉片用于誘導(dǎo)四倍體。

2.2 試驗方法

2.2.1 試驗設(shè)計

如表1，采用多因素多水平完全試驗設(shè)計誘導(dǎo)二倍體楸葉泡桐，最終得到四倍體植株。并比較四倍體誘導(dǎo)率和植株生長情況，篩選出誘導(dǎo)四倍體的最佳組合。外槽體預(yù)培養(yǎng)時間、秋水仙素濃度和秋水仙素處理時間分別為，O、6、12 d，10、20、30 mg/L和24、48和72h（表1）。

2.2.2 四倍體楸葉泡桐的誘導(dǎo)

取上述方法培育的楸葉泡桐幼苗，將形態(tài)學(xué)上端向下數(shù)的第2～4對葉片，除去葉緣后，剪成1.O cm×1.O cm小塊（外植體），分別接種于盛有40 mL的MS+NA A O.3 mg/L+B A 140 mg/L培養(yǎng)基[11]的100mL三角瓶中，在上述溫度和光照條件下預(yù)培養(yǎng)O，6和12 d后，再置于秋水仙素濃度分別為10、20和30mg/L的液體培養(yǎng)基[9 ]中浸泡處理，最后在溫度為20℃的黑暗條件下誘導(dǎo)處理24、48和72 h。結(jié)束后，無菌水清洗外植體3次，而后轉(zhuǎn)入不含秋水仙素的上述固體培養(yǎng)基上，于上述溫度和光照條件的培養(yǎng)室內(nèi)進行培養(yǎng)。每處理共60個外植體。到40 d時，統(tǒng)計外植體存活數(shù)及出芽數(shù)，并計算其存活率和芽誘導(dǎo)率。

當(dāng)誘導(dǎo)出的幼芽長到約2 cm時，從基部剪斷放入1/2 MS培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根，20 d繼代1次，第5次繼代苗培養(yǎng)20 d時，觀察染色體倍性[8]并用流式細胞儀確認染色體數(shù)變化的楸葉泡桐幼苗的倍性[8]，并計算同源四倍體誘導(dǎo)率。

2.2.3 四倍體楸葉泡桐的鑒定

（1）幼苗根尖染色體計數(shù)。將制成的二倍體和誘導(dǎo)變異的楸葉泡桐根尖臨時壓片放于尼康TS -100熒光倒置顯微鏡（×2 000）下，觀察其染色體條數(shù)并拍照。

（2）測定葉片單細胞相對DNA含量。測定二倍體和染色體加倍的楸葉泡桐葉片的相對DNA含量參照張變莉等[8]的方法。

2.2.4 幼苗形態(tài)變化

觀察上述生長40 d的第5次繼代的二倍體和染色體加倍后的楸葉泡桐幼苗的葉片大小、葉色、整株生長等差異。每指標(biāo)測定10個樣品，最后求平均值。

二倍體和染色體加倍后的楸葉泡桐成熟葉片的氣孔器大小和密度測定參見張變莉等[8]的方法。

2.2.5數(shù)據(jù)處理

參見張變莉等[8]的方法。

3 結(jié)果與分析

3.1 不同處理組合對四倍體楸葉泡桐誘導(dǎo)的影響

由表1和表2可知，外植體預(yù)培養(yǎng)時間、秋水仙素質(zhì)量濃度和處理時間的不同組合處理，對楸葉泡桐外植體存活率、芽誘導(dǎo)率和四倍體誘導(dǎo)率均有一定影響，但影響程度并不相同。其中秋水仙素處理時間和其質(zhì)量濃度的變化對外植體存活率、芽誘導(dǎo)率均產(chǎn)生了極顯著的影響。當(dāng)秋水仙素質(zhì)量濃度和外植體預(yù)培養(yǎng)時間一定時，隨著處理時間的延長，外植體存活率和芽誘導(dǎo)率總體上呈下降趨勢，四倍體誘導(dǎo)率則沒有一致的變化趨勢，但不同處理組合間差異顯著;當(dāng)秋水仙素處理時間和外植體預(yù)培養(yǎng)時間一定時，隨著秋水仙素質(zhì)量濃度的增大，葉片存活率、芽誘導(dǎo)率和四倍體誘導(dǎo)率也出現(xiàn)上述相似的變化趨勢。這表明，楸葉泡桐葉片四倍體誘導(dǎo)率最高的處理組合（組合17）既不是外植體存活率和芽誘導(dǎo)率最高的組合（組合10），也不是外植體存活率和芽誘導(dǎo)率最低的組合（組合18）。此外，預(yù)培養(yǎng)時間對外植體存活率、芽誘導(dǎo)率有顯著影響，但對四倍體誘導(dǎo)率影響不顯著。楸葉泡桐葉片存活率和芽誘導(dǎo)率在組合10（預(yù)培養(yǎng)6 d+秋水仙素10 mg/L+處理24 h）中，預(yù)培養(yǎng)時間為6d時達到最高，分別為57. 32%和24. 08%。綜上所述，楸葉泡桐最高四倍體誘導(dǎo)率的產(chǎn)生是秋水仙素濃度、處理時間和外植體預(yù)培養(yǎng)時間共同作用的結(jié)果。因此，楸葉泡桐四倍體誘導(dǎo)的最佳方案是組合17（預(yù)培養(yǎng)6 d+秋水仙素30 mg/L+處理48 h）。

3.2 鑒定楸葉泡桐變異幼苗的倍性

3.2.1 觀察變異幼苗的染色體

如圖1，誘變的楸葉泡桐幼苗的根尖細胞染色體條數(shù)為2n=4x=80，但正常二倍體楸葉泡桐的則為2n-2x=40（圖1）。這表明，發(fā)生誘變的楸葉泡桐幼苗細胞中的染色體數(shù)為正常二倍體的2倍。

3.2.2 測定變異幼苗葉片單細胞的DNA含量

由圖2可以看出，對照的二倍體幼苗僅在相對熒光強度值為50的位置上出現(xiàn)1個單峰，變異的楸葉泡桐也只在接近100的位置上出現(xiàn)1個單峰。因此，秋水仙素處理后獲得的楸葉泡桐變異幼苗均為四倍體楸葉泡桐幼苗。

3.3 幼苗形態(tài)變化

比較楸葉泡桐二倍體和四倍體幼苗的形態(tài)（表3和圖3）可以發(fā)現(xiàn)，與二倍體幼苗相比，四倍體幼苗葉片顯著變大、增厚，葉色加深，葉片長寬比減小。四倍體楸葉泡桐葉片氣孔明顯大于二倍體，但其葉片的氣孔密度與二倍體相比明顯變小。

4 討論

植物細胞染色體加倍與染色體誘變劑種類及其處理濃度、時間等因素有關(guān)。眾所周知，秋水仙素是目前植物多倍體誘導(dǎo)中使用最廣泛效果最好的化學(xué)誘變劑之一，它是生物細胞分裂中期紡錘絲形成的抑制劑。有研究發(fā)現(xiàn)，在植物多倍體誘導(dǎo)中，不同的植物細胞對秋水仙素的敏感性不同，同一種植物材料的誘導(dǎo)對最適秋水仙素濃度和處理時間組合也不盡相同[10-11]。對泡桐來說，獲得白花泡桐、臺灣泡桐等同源四倍體最高誘導(dǎo)卒的最適處理組合也有不同[4-6]。本實驗中，處理17是楸葉泡桐四倍體誘導(dǎo)率最高的組合，即預(yù)培養(yǎng)6d的葉片在秋水仙素質(zhì)量濃度為30 mg/L的液體培養(yǎng)基上處理24 h。該組合不是最長處理時間和最高濃度的處理，這說明，本試驗的秋水仙素處理時間和質(zhì)量濃度達到極限。本試驗以預(yù)培養(yǎng)的楸葉泡桐葉片為材料，用不同濃度的秋水仙素處理，獲得的誘變幼苗大部分為四倍體且可以穩(wěn)定遺傳。其原因可能是用30 mg/L秋水仙素處理預(yù)培養(yǎng)6d的白花泡桐葉片24 h時，由于葉片薄，細胞分裂旺盛、同步性好，此時秋水仙素易抑制紡錘絲的形成，從而導(dǎo)致大量的細胞染色體加倍，因此變異幼苗中出現(xiàn)嵌合體的機率就小。

參考文獻：

[l]張紅亮，朱永琴，李 霞，等，植物多倍體育種的探討[J].種子科技.2013，31（7）：40-42.

[2]彭靜，魏岳榮，熊興華，植物多倍體育種研究進展[J].中國農(nóng)學(xué)通報，2010，26（11）：45-49.

[3]喬永剛，宋 蕓.我國園藝植物多倍體育種研究進展[J].北方園藝，2002（6）：7-8.

[4]范國強，曹艷春，趙振利，等，白花泡桐同源四倍體的誘導(dǎo)[J].林業(yè)科學(xué).2007，43（4）：31-35.

[5]魏真真.豫雜一號泡桐和南方泡桐同源四倍體誘導(dǎo)及其體外植株再生的研究[D].鄭州：河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2008.

[6]何佳.9501泡桐和懸鈴木四倍體誘導(dǎo)的研究[D].鄭州：河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2010.

[7]王楊.楸葉泡桐和臺灣泡桐四倍體誘導(dǎo)及其體外植株再生體系建立[D].鄭州：河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2014.

[8]張變莉，王楊，劉榮寧，等.臺灣泡桐體細胞同源四倍體的誘導(dǎo)及鑒定[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016.44（6） ：290-293.

[9]韓同麗.四種泡桐體外植株再生體系建立[D].鄭州：河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2013.

[1O]Tambong J T， Sapra V T， Garton S.In vitro induction of tetra-ploids in colchicine - treated cocoyam plantLets[J]. Euphytica，1998，104（3）：191-197.

[ll]Jane Fiuza Rodrigues Portela de Carvalho， Carlos Roberto de Por-tela de Carvalho， Wagner Campos Otoni. In vttro induction ofpolyploidy in annatto （Bixa orellana） [J]. Plant Cell， Tissue andOrgan Culture， 2005， 80（1）： 69-75.

收稿日期：2019-09-11

基金項目：河南省鄭州市普通科技攻關(guān)項目（編號：153PKJGG423）;河南省杰出人才創(chuàng)新基金項目（編號：321001700）;河南省高校杰出科研人才工程基金項目（編號：2002KYC-003）

作者簡介：張變莉（1982 -），女，講師，碩士，主要從事園林綠化及林木生物技術(shù)的教學(xué)和科研工作。

通訊作者：范國強（1964 -），男，教授，博士，主要從事泡桐生物技術(shù)的研究。