復合乳酸菌發酵果蔬乳飲料的研制

關成冉，蔣欣容，馬雁，陳大衛，張臣臣，印伯星，李啟明，顧瑞霞，*

（1.揚州大學江蘇省乳品生物技術與安全控制重點實驗室，江蘇揚州225127；2.新希望乳業控股有限公司，四川成都610000）

隨著現代社會生活節奏加快及飲食結構的變化，慢性便秘的發生率呈逐漸上升趨勢，嚴重影響人們的生活質量，并可能誘發其他疾病，飲食習慣、精神壓力、年齡等因素都能誘發便秘[1]。傳統藥物治療如服用瀉藥，雖然能很快緩解便秘癥狀，但不能從根本上解決問題。長期使用瀉藥還易造成腸道菌群失衡，一些刺激性瀉藥甚至會損害腸道神經，導致更為嚴重的便秘[2-3]。因此，找尋一種安全有效的飲食或保健干預措施進行便秘防治顯得非常必要。

研究顯示，利用益生菌和膳食纖維可治療便秘。乳酸菌代謝產生多種有機酸，刺激腸道分泌腸液，促進腸道蠕動；抑制腸道內病原菌，改善腸道微環境，緩解便秘癥狀[4-5]。膳食纖維能夠提高糞便持水能力或促進腸道蠕動，改善便秘[6-7]。本文利用具有益生特性的乳酸菌混合發酵，通過添加香蕉漿、紅薯漿和低聚果糖，擬開發一款具有潤腸通便功效的發酵乳飲料。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

中性蛋白酶（50 U/mg）：美國sigma公司；脫脂乳粉：新西蘭恒天然集團；Luria-Bertani、Reinforced Clostridium Medium液體培養基：廣東環凱微生物科技有限公司；乳清粉：上海昊岳實業有限公司；低聚果糖：洪昌生物科技有限公司；食品級Ca（OH）2：上海江滬鈦白化工制品有限公司；香蕉、紅薯：市售。

ZHJH-C1209B超凈工作臺：上海智城分析儀器制造有限公司；SPX-150BS-Ⅱ生化培養箱：上海新苗醫療器械制造有限公司；Millipore Direct 8超純水儀：美國Millipore公司；JYB60-08高壓均質機：上海東華高壓均質機廠；JM 60B膠體磨：上海帥發包裝印刷設備。

1.2 試驗菌株及發酵劑制備

Lactobacillus rhamnosus grx19、Lactobacillus casei g9、Lactobacillus plantarum s7、Lactobacillus acidophilus ss、Bifidobacterium animal BLC、Streptococcus thermophilus 90-57，均由江蘇省乳品生物技術與安全控制重點實驗室分離保藏。按活菌數1∶1∶1∶1∶1∶1比例制備而成的混合乳酸菌發酵劑，按照4%接種量，接種發酵。

大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、假單胞菌：購于中國工業微生物菌種保藏中心。

1.3 果蔬培養基制備

乳清粉處理液的制備：將75%乳糖含量的脫鹽乳清粉加水溶解，制備成質量分數為15%乳清粉溶液，添加乳清粉溶液量0.225%的食品級Ca（OH）2，95℃加熱3 h，冷卻備用。

香蕉漿的制備：香蕉去皮，沸水熱燙8 min護色處理，按照體積比1∶1加水打漿，經熱處理后冷卻備用。

紅薯漿的制備：紅薯去皮，蒸煮8 min，按照體積比1∶1加水打漿，經熱處理后冷卻備用。

1.4 香蕉漿、紅薯漿和低聚果糖添加量的單因素試驗

依次改變發酵溫度、發酵時間、香蕉漿、紅薯漿和低聚果糖添加量做單因素試驗，以發酵果蔬的pH值、酸度、抑菌能力作為考核指標。發酵過程中以乳清粉處理物和脫脂乳為發酵基質，接種量為4%，每隔4 h取樣，每次保持4個量不變，只改變考察量。

1.4.1 發酵溫度

固定香蕉漿、紅薯漿和低聚果糖的添加量為15%、5%及 5%，培養時間 24 h，分別在 34、36、38、40、42 ℃條件下發酵，取樣測定考核指標。

1.4.2 發酵時間

固定香蕉漿、紅薯漿和低聚果糖的添加量為15%、5%及 5%，38℃分別發酵 12、18、24、30、36 h時，取樣測定考核指標。

1.4.3 香蕉漿添加量

固定紅薯漿和低聚果糖的添加量為5%及5%，38℃，發酵24h，香蕉漿添加量分別為5%、10%、15%、20%、25%，取樣測定考核指標。

1.4.4 紅薯漿添加量

固定低聚果糖及香蕉漿添加量為5%及15%，38℃發酵24h，紅薯漿添加量分別為5%、10%、15%、20%、25%，取樣測定考核指標。

1.4.5 低聚果糖添加量

香蕉漿及紅薯漿添加量為15%及10%，38℃，發酵24 h，低聚果糖添加量分別為1%、2%、3%、4%、5%，取樣測定考核指標。

1.5 試驗數據測定

活菌數測定：按GB 4789.35-2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗乳酸菌檢驗》[8]，采用平板計數法測定。

酸度測定：按GB5009.239-2016《食品安全國家標準食品酸度的測定》，采用0.1 mol/L的NaOH溶液測定。

抑菌活性測定：以酶解脫脂乳培養基為空白對照，采用雙層瓊脂擴散打孔法，37℃培養12 h后測定乳酸菌抑菌活性。

1.6 數據整理和分析

采用SPSS20、Design Expert軟件對數據進行處理。

2 結果與分析

2.1 最適發酵溫度的確定

溫度可影響復合乳酸菌發酵果蔬乳飲料的產酸速率、活菌數及抑菌能力，見圖1A、圖1B和圖1C。

圖1 發酵溫度對發酵乳飲料的影響Fig.1 The effect of fermentation temperature on the beverage

低于38℃，產酸速率隨溫度增加而加快，高于38℃產酸速率減慢；在38℃培養，復合乳酸菌發酵果蔬乳飲料含有最高活菌數并對4株病原菌的抑制能力最強。因此，選擇38℃為復合乳酸菌發酵果蔬乳飲料的最適發酵溫度。

2.2 最適發酵時間的確定

發酵時間影響復合乳酸菌發酵果蔬乳飲料產酸速率、活菌數及抑菌能力，見圖2A、圖2B和圖2C。

結果顯示：酸度在發酵過程中一直上升，在6 h～24 h內上升較快，24 h后上升速度變慢；活菌數在發酵6 h～24 h快速增加，24 h之后活菌數快速下降；而抑菌能力在發酵過程中逐漸增強，24 h后增加趨勢平緩。綜上，選擇24 h為最適發酵時間。

圖2 發酵時間對對發酵乳飲料的影響Fig.2 The effect of fermentation time on the beverage

2.3 混合乳酸菌發酵果蔬乳飲料中香蕉漿、紅薯漿、低聚果糖添加量的確定

在所確定的發酵條件下，通過單因素試驗，研究香蕉漿添加量、紅薯漿添加量、低聚果糖對乳酸菌飲料的影響。

2.3.1 最適香蕉漿添加量的確定

香蕉漿添加量對發酵乳飲料的影響見圖3。

圖3 香蕉漿添加量對發酵乳飲料的影響Fig.3 The effect of banana on the beverage

香蕉漿添加量低于15%時，混合乳酸菌發酵果蔬乳飲料的產酸速率（圖3A）、活菌數（圖3B）及抑菌能力（圖3C）均呈快速上升趨勢；高于15%時則相反。因此，香蕉漿適宜添加量為15%。

2.3.2 紅薯漿添加量的確定

紅薯漿添加量對發酵乳飲料的影響見圖4。

圖4 紅薯漿添加量對發酵乳飲料的影響Fig.4 The effect of sweet potato on the beverage

紅薯漿添加量低于10%時，混合乳酸菌發酵果蔬乳飲料的產酸速率（圖4A）、活菌數（圖4B）及抑菌能力（圖4C）均呈快速上升趨勢；高于10%時則相反。因此，紅薯漿適宜添加量為10%。

2.3.3 低聚果糖添加量的確定

低聚果糖添加量對發酵乳飲料的影響見圖5。

圖5 低聚果糖添加量對發酵乳飲料的影響Fig.5 The effect of fructo-oligosaccharides on the beverage

發酵果蔬乳飲料的產酸速率（圖5A）、活菌數（圖5B）及抑菌能力（圖5C）在低聚果糖添加范圍內均呈上升趨勢，相較于產酸速率，當低聚果糖添加量高于3%時，增加趨勢不顯著（P>0.05）。綜上，低聚果糖的適宜添加量為3%。

2.4 響應面試驗

2.4.1 優化試驗及結構

在單因素試驗的基礎上，以香蕉漿添加量（A，%）、紅薯漿添加量（B，%）、低聚果糖添加量（C，%）為變量進行響應曲面優化，以活菌數量（Y，lg CFU/mL）為指標，對混合乳酸菌發酵果蔬乳飲料的配方進行優化，響應面結果見表1。

表1 響應面試驗表Table 1 Response surface table

2.4.2 模型的建立及其顯著性檢驗

通過Design Expert軟件對試驗結果進行分析，確定混合乳酸菌發酵果蔬乳飲料活菌數對香蕉漿添加量、紅薯漿添加量、低聚果糖添加量的二次多項回歸方程為：

方差分析表見表2。由方差分析結果可得，該模型P=0.000 1<0.01，具有高度顯著性，能充分表明各因素之間的關系；模型中A2（P=0.001 1<0.01），B2（P<0.000 1），C2（P=0.003 7<0.01），對活菌數量影響顯著；由F值可知，在該模型中，各因素對活菌數量影響大小依次為，紅薯漿添加量>低聚果糖>香蕉漿添加量。模型失擬性檢驗P=0.107 9，失擬性不顯著，方程對試驗擬合較好，模型能準確模擬各因素對乳飲料的影響；模型決定系數R2=0.988 5，能夠很好地反應95%的試驗結果。

表2 二次多項式模型方差分析表Table 2 Analysis of variance table of quadratic polynomial model

2.4.3 響應曲面分析與優化

因素間的交互作用見圖6、圖7和圖8。

圖6 香蕉漿和紅薯漿添加量交互作用對活菌數影響的響應曲面和等高線Fig.6 Response surface plot of percent of banana and sweet potato

圖7 香蕉漿和低聚果糖添加量交互作用對活菌數影響的響應曲面和等高線Fig.7 Response surface plot of percent of banana and fructooligosaccharides

圖8 紅薯漿和低聚果糖添加量交互作用對活菌數影響的響應曲面和等高線Fig.8 Response surface plot of percent of sweet potato and fructooligosaccharides

比較3個圖可知，香蕉漿添加量和紅薯漿添加量之間的交互作用最大，而且交互作用呈倒鐘形，表明擬合面有真實最大值。

對等高線分析，香蕉漿添加量和紅薯漿添加量之間的等高線最密集，其交互作用對活菌數量影響最大，但總體而言，活菌數量都是隨各因素變化呈先上升后下降趨勢，在特定范圍內獲得最高活菌數量。

利用軟件，獲得混合乳酸菌發酵果蔬乳飲料優化配方為：乳清粉處理物和脫脂乳為發酵基質（含5%乳清粉和3%脫脂乳粉），紅薯漿添加量為10.44%，低聚果糖添加量為2.23%，香蕉漿添加量為15.67%。考慮到實際操作，將工藝參數修改為：紅薯漿添加量為10%，低聚果糖添加量為2%，香蕉漿添加量為16%。

2.5 貯藏穩定性的研究

對貯藏35 d內發酵果蔬乳飲料的酸度、活菌數、抑菌性的變化情況進行測定，結果見圖9。

圖9 儲藏期時間對發酵乳飲料的影響Fig.9 The effect of storage period on the beverage

酸度在儲藏0～21 d上升較慢，由118.45°T上升至第21天的126.19°T，對應的活菌數由9.48 lg CFU/mL下降到9.0 lg CFU/mL，21 d后酸度上升較快，總儲藏期酸度上升至134.44°T，上升幅度為13.49%，對應的活菌數由9.0 lg CFU/mL下降到8.28 lg CFU/mL。儲藏35 d過程中，混合乳酸菌發酵果蔬乳飲料抑制病原菌能力不斷增強。

3 討論與結論

益生菌已被證明對便秘患者具有潤腸通便的作用。目前關于益生菌與便秘相關的機制主要有兩種，一是在腸道內產生有機酸、修復和促進腸道的功能，來降低腸腔的pH值，調節腸道的神經肌肉活性，增強腸道的蠕動能力；二是有效抑制腸道內腐敗菌的滋生，改善腸道環境，使得糞便松軟而利于排泄[9-10]。便秘患者腸道微生物中需氧菌、真菌、梭桿菌和大腸埃希菌比例相對增加，厭氧菌、類桿菌、乳酸桿菌和雙歧桿菌等顯著減少。乳酸桿菌代謝產生乳酸等有機酸可改善腸道環境，促進食物的消化，提高礦物質利用率和維生素的吸收等，還具有抑制腸內致病菌，促進輔助性T細胞Th1發育，誘導產生多種細胞因子，增強細胞免疫功能[11]。雙歧桿菌具有抗感染、抗腫瘤、增強機體免疫力、合成多種維生素、促進營養物質的吸收等突出益生作用，研究發現便秘組老年人雙歧桿菌含量明顯降低，而腐敗梭菌等條件致病菌數量顯著增高[12]。綜上，同時考慮發酵乳感官品質，本研究采用了6種益生菌作為發酵劑。

香蕉和紅薯富含膳食纖維，具有增強胃腸道推進作用和抑制腸道吸收液體，促進腸液分泌，機械性刺激腸壁而使蠕動增強的作用[13]；低聚果糖在體內外均對雙歧桿菌有顯著地增殖作用，并在腸道內通過雙歧桿菌發酵，產生大量的短鏈脂肪酸，刺激腸道蠕動、增加糞便濕潤度并保持一定的滲透壓，從而防止便秘的產生，對產莢膜梭菌、大腸桿菌、艱難梭菌的生長有一定的抑制作用[14-15]。研究表明，益生菌和膳食纖維均可不同程度的改善便秘，而益生菌聯合膳食纖維可顯著改善便秘[16]。因此，在以6種乳酸菌為發酵劑的基礎上，添加香蕉漿、紅薯漿及低聚果糖。

本試驗混合6株發酵特性突出的益生菌，通過優化發酵溫度、發酵時間及香蕉漿、紅薯漿、低聚果糖等的添加量，制備具有潤腸通便功效的復合乳酸菌發酵果蔬乳飲料，具有產酸速率較快，活菌數較高，對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、假單胞菌具有較強的抑制能力等特點。同時，該產品在貯藏期內保持一定的酸度、活菌數及抑菌能力。該飲料的潤腸通便功效將在下一步的試驗中進行驗證。