水蒸氣蒸餾法與超臨界CO2萃取法結合氣相色譜-質譜分析胡椒木精油成分
2019-01-22 11:15:30杜麗君牛先前林曉紅鄭國華
分析測試學報 2019年1期
杜麗君，牛先前，林曉紅，鄭國華
(1.漳州城市職業學院，福建 漳州 363000；2.福建農林大學 園藝學院，福建 福州 350002；3.福建省熱帶作物科學研究所，福建 漳州 363001)
胡椒木(Zanthoxylumpiperitum‘Odorum’)為蕓香科(Rutaceae)花椒屬(ZanthoxylumL.)植物，其全株具濃烈胡椒香味，自身少有病蟲害(目前僅發現偶有炭疽病及蚜蟲)，且周邊植物也少有病蟲害。研究發現胡椒木葉片精油中含有肉桂酸甲酯、檸檬烯、α-蒎烯、松油醇、香茅醛、β-水芹烯、α-石竹烯等多種驅蟲、殺蟲、殺菌成分[1]。同時，諸多研究報道，花椒屬植物含有如生物堿[2-3]、類黃酮物質[4-5]、不飽和脂肪酸酰胺[6]、萜類化合物[7]等多種生理活性物質，具有抗菌抗病毒、驅蟲殺蟲、鎮痛止癢、抑制血小板凝集、抗癌等生理藥理功效[8]，在醫療保健、食品工業和日化產品[9]等領域具有巨大的應用潛力。因此，利用胡椒木次生代謝物的驅蟲抗菌及諸多有利于人體的藥理活性特點，研究綠色環保的植物農藥來替代化學合成類農藥是減少環境污染、降低生態壓力、營造更利于人類健康生態環境的可行之路。
目前，有關植物驅蟲抗菌活性物質的研究，較深入且具有產業發展前景的是花椒屬植物，但花椒、胡椒產量的95%以上為食品原料，且受栽培技術、種植區域限制，而胡椒木具有易栽培、速生、產量高的特點，滿足產業化發展的條件。本研究通過水蒸氣蒸餾(SD)法和超臨界CO2萃取(SC-CO2)法分別提取胡椒木葉片精油，利用GC-MS分析了其組成成分，并對比溶劑萃取法及抗氧化性檢測結果，重點探討了不同提取方法對提取成分中驅蟲抗菌活性物質的影響，為胡椒木精油的分離、提取、組分研究及綠色環境友好型植物農藥的開發提供科學依據。
1 實驗部分
1.1 儀器與材料
氣相色譜/質譜聯用儀(美國Varian Saturn 3900/2100)、HA 220-50-06 CO2超臨界萃取裝置(南通市華安超臨界有限公司)、LGJ-25C冷凍干燥機(北京四環科學儀器廠有限公司)。
胡椒木為2年生盆栽苗(株高50 cm、冠徑50 cm，購自福建省福州市繽紛花木市場)，先在福建農林大學園藝學院盆栽試驗場培養45 d，于9月中旬采摘生長健壯、無病蟲危害的完整葉片，單蒸水沖洗，混勻、晾干后，凍干，微粉成直徑小于0.46 mm的粉末，準確稱取20 g用自封袋分裝，置于-40 ℃冰箱中儲存備用。
1.2 胡椒木精油提取方法
1.2.1水蒸氣蒸餾(SD)法參照《中華人民共和國藥典》[10]中揮發油的測定方法進行精油的提取，取胡椒木葉片20 g，采用正交試驗優化的提取時間、NaCl濃度、料液比，以精油得率為考察值，確定最佳提取條件。
1.2.2超臨界CO2萃取(SC-CO2) 取胡椒木葉片20 g，采用正交試驗優化的萃取時間、萃取壓力、萃取溫度，以精油得率為考察值，確定最佳提取條件。
精油得率(%)=萃取精油質量/鮮樣質量×100%。
1.3 GC-MS條件與測定
精油樣品進樣前處理：樣品經干燥，石油醚(60～90°)稀釋20倍后過0.22 μm有機濾膜，取1.5 mL待測。
色譜條件：采用DB-5MS色譜柱(300 mm×0.25 mm×0.25 μm)，載氣：He(99.999%)，流速1 mL/min(恒流模式)，進樣量10 μL。傳輸線溫度：280 ℃，進樣口溫度：250 ℃；程序升溫：起始溫度50 ℃，保留5 min；以5 ℃/min升至260 ℃，保留2 min。
質譜條件：電離方式為EI，電子能量70 eV，阱溫220 ℃。在40～650 amu的質量范圍內進行全掃描，記錄總離子流色譜圖(TIC)，以質譜鑒定各色譜峰的化學成分，峰面積歸一法確定其相對含量。
1.4 抗氧化活性測定
將所得精油配制成2、4、6、8、10、12、14、16、18、20 mg/mL的精油乙醇溶液，備用。
DPPH·自由基清除能力測定：參考Feresin G E等[11]的方法，以同濃度的2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)為對照。
還原力測定：參考邢思雷等[12]的方法，以同濃度的抗壞血酸(Vc)為對照。
1.5 統計分析
采用EXCEL、DPS 7.05版軟件數據處理，SigmaPlot.v10.0軟件作圖。
2 結果與討論
表1 SD法正交試驗因子水平表Table 1 Factor levels of orthogonal experiment design by steam distillation
表2 SC-CO2法正交試驗因子水平表
2.1 兩種提取方法的正交試驗優化
在單因子試驗基礎上，SD法選擇提取時間、NaCl濃度、料液比，SC-CO2法選擇萃取時間、萃取壓力、萃取溫度分別進行3因子3水平(33)正交試驗(表1～2)，以精油得率為考察指標，分別考察2種提取方法的最佳提取條件。結果表明：SD法的最佳提取條件為提取時間4 h，NaCl濃度0%，料液比1∶6，此條件下精油得率為0.561 1%(n=3),高于正交試驗方案中的最高值(0.550 1%)；SC-CO2法最佳提取條件為萃取時間為2.5 h，萃取壓力為25 MPa，萃取溫度為30 ℃，此時，精油得率為0.953 2%(n=3)高于正交試驗方案中的最高值(0.892 8%)，表明對2種提取方法提取條件的優化是有效的。
2.2 兩種提取方法的GC-MS分析與鑒定
SD法和SC-CO2法提取的胡椒木葉片精油總離子流圖見圖1。各色譜峰對應的質譜圖經人工解析及計算機譜庫檢索確認。結果顯示，SD法提取精油中鑒定出34種化學成分，占總成分的92.28%，包括16種烯烴、5種醇、5種酯、2種醛、1種酸、1種酮和4種其他物質。SC-CO2法提取精油中鑒定出34種化學成分，占總成分的99.77%，包括15種烯烴、5種醇、6種酯、1種醛、1種酸、1種酮和5種其他物質。詳細化學成分及鑒定結果見表3。
No.Retentiontime/minCompoundMolecular formulaContent( %)SDSC-CO216.271m-Xylene(間二甲苯)C8H10<0.10.11±0.0328.506α-Pinene(α-蒎烯)C10H160.73±0.06<0.139.939β-Phellandrene(β-水芹烯)C10H160.65±0.050.1±0.02410.126β-Pinene(β-蒎烯)C10H160.25±0.031.21±0.21510.609β-Myrcene(β-月桂烯)C10H168.41±0.56-611.165α-Phellandrene(α-水芹烯)C10H160.29±0.06<0.1711.956Limonene(檸檬烯)C10H16-11.13±1.21812.166Styrene(苯乙烯)C8H843.25±7.85-912.984γ-Terpinene(γ-松油烯)C10H160.29±0.050.14±0.011013.886Terpinene(異松油烯)C10H160.67±0.070.15±0.011114.393Linalool(哩哪醇)C15H26O0.19±0.06<0.11215.146Methyl octanoate(辛酸甲酯)C9H18O20.56±0.090.20±0.011316.069Citronellal(香茅醛)C10H18O0.18±0.040.1±0.011417.2142-Cyclohexen-1-one,4-(1-methylethyl)(4-異丙基-2-環己基烯酮)C9H14O0.15±0.030.1±0.011517.546Myrtenol(桃金娘醛)C10H16O<0.1-1617.844Piperitol(薄荷醇)C10H20O0.10±0.010.12±0.011718.198Nonanoic acid-methyl ester(壬酸甲酯)C10H20O20.10±0.01<0.11818.945Linalyl acetate(乙酸芳樟酯)C12H20O2<0.10.12±0.011921.711α-Terpinene(α-松油烯)C10H160.72±0.030.30±0.012022.924Methyl cinnamate
-:not detected
2.3 兩種提取方法獲得精油的化學成分及相對含量差異
對比SD法與SC-CO2法提取精油的化學成分結果(表3)發現，兩種提取方法中相同的化合物包括13種烯烴、5種醇、4種酯、1種醛、1種酸、1種酮和3種其他物質，共28種，其中，已被證實具有驅蟲抗菌活性的物質有：α-蒎烯[13]、肉桂酸甲酯[14]可抑制多種病原菌的生長、繁殖，具良好的抗菌活性；香茅醛[15]、薄荷醇[16]對蚊蟲具有較理想的趨避和擊倒活性；石竹烯、α-石竹烯是驅避和毒殺蚊蟲的有效成分[17]。但28種相同物質的含量均存在明顯差異，如順式肉桂酸甲酯在SC-CO2法提取液中的相對含量(73.91%)為SD法(30.33%)的2倍多；α-石竹烯在SC-CO2法提取液中含量(4.12%)為SD法(1.81%)的2倍多；β-蒎烯在SC-CO2法提取液中為1.21%，在SD法提取液中為0.25%；石竹烯在SC-CO2法提取液中為1.74%，而在SD法提取液中僅0.73%。產生差異的原因是：SD法提取精油過程中，在高溫水蒸氣的作用下，胡椒木精油中的β-蒎烯極可能被轉化為α-蒎烯和莰烯，也會在氧氣的作用下進一步被氧化為β-蒎烯氧化物和少量的桃金娘醛[18]；β-蒎烯熱裂解可獲得β-月桂烯[19]；松油烯可由α-蒎烯通過催化劑合成，也可由松油醇在酸作用下脫水而成[20]。本研究在SD法提取的精油中檢出α-蒎烯(0.73%)、桃金娘醛(<0.01%)、β-月桂烯(8.41%)和相對含量較高的松油烯(包括α-松油烯、γ-松油烯和異松油烯)，對照SC-CO2法的檢測結果可見，SD法對具有驅蟲抗菌活性的物質破壞較大。
除28種相同化合物外，SC-CO2法提取液中檢出大量檸檬烯(11.13%)，與溶劑萃取法提取胡椒木葉片精油[1]研究結果一致，而SD法中未檢出。其原因可能與本研究中SD法的提取條件有關，檸檬烯雖可用SD法提取，但其本身是一種化學性質非常活潑的單萜，提取過程中的高溫可使檸檬烯自動氧化成檸檬烯氧化物、香芹酮、香芹醇、檸檬烯二氫過氧化物等[21]一系列的氧化單環單萜。檸檬烯具有強大的抗菌活性，可抑制多種病原菌生長、繁殖[13]，其對蚊蟲及其他昆蟲也具有明顯的驅避及毒殺活性[22-23]。SD法檢出大量苯乙烯(43.25%)，SC-CO2法未檢出，但檢出大量順式肉桂酸甲酯(73.91%)，可能是采用SD法提取過程中肉桂酸甲酯受熱時脫羧基而生成苯乙烯。因此，從獲得精油的驅蟲抗菌活性而言，SC-CO2法優于SD法。
綜上所述，SC-CO2法較SD法獲得的胡椒木葉片精油保留了更多的驅蟲抗菌活性物質，是較理想的提取方法。
2.4 抗氧化活性測定
研究表明，花椒屬植物精油具有很強的清理DPPH·自由基的能力[24]。本研究中胡椒木葉片精油抗氧化活性的測定結果表明，SC-CO2法與SD法所獲精油均具有清除DPPH·自由基的能力，且隨著提取精油濃度的增加清除能力呈增強趨勢，但SC-CO2法提取物的清除能力明顯優于SD法(圖2A)。SC-CO2法提取精油清除DPPH·自由基能力在8 mg/mL時達到對照BHT抑制率的97.27%，而SD獲得的精油在20 mg/mL的抑制率僅為對照的14.27%。采用線性回歸計算得到SC-CO2法清除DPPH·自由基的IC50為3.173 3，而SD法無法計算。說明在保留胡椒木葉片精油中清除DPPH·自由基能力物質的穩定性方面，SC-CO2法優于SD法。
兩種提取方法獲得精油的還原力具有差異，SC-CO2法提取精油的還原力隨精油濃度的增加呈增強趨勢，而SD法增加不顯著(圖2B)。SC-CO2法提取精油的還原力在20 mg/mL達到對照Vc的34.86%，而SD獲得的精油在20 mg/mL的還原力僅為對照的5.98%。說明，SC-CO2法對胡椒木中還原性物質的保護較好，而SD法對這類物質破壞較大。
無論在清除DPPH·自由基能力還是在還原性方面，SC-CO2法>溶劑萃取法[1]>SD法。說明SC-CO2法提取方法對胡椒木精油中酚類、萜類等還原性和抗氧化性物質的保留或萃取效果要優于SD法。
3 結 論
本文采用優化的SC-CO2法和SD法提取了胡椒木葉片精油并采用GC-MS分析，結合獲得精油的抗氧化性測定，對兩種提取工藝的成分進行了分析驗證。結果顯示，胡椒木精油含有多種驅蟲、殺蟲、抗菌等生物活性物質，但不同提取工藝的選擇對獲得胡椒木精油中活性成分具有一定差異，SC-CO2法對精油的天然成分破壞較少，保留了大量活性成分，且精油獲得量較高，而SD法在溫度控制、萃取溶劑等方面尚有較多缺陷，需進一步優化。另外，僅用精油獲得量作為考察指標，具有一定的局限性。本文對開發以胡椒木為原料的綠色植物源農藥提供了參考。
