急性心肌梗死患者心臟破裂與ECM蛋白、ECM輔助性分子及GDF-15的相關性研究

楊宇杰 陳大興 潘華鋒 陶立軒 郭寧 王杰

(武漢科技大學附屬普仁醫院心胸外科，湖北 武漢 430081)

隨著我國人們生活水平的升高、人口老齡化的加重、生活方式及飲食習慣的改變，急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)的發病率逐年升高，住院治療患者也相對增多[1]。近年來，由于醫學技術的發展進步，多中心循證醫學試驗的大規模實施，外加AMI患者手術介入治療及藥物使用的規范，尤其是AMI臨床治療指南的制定，使得AMI的臨床治療更加統一科學有效[2]。目前臨床上綜合藥物、靜脈內溶栓、冠狀動脈血運重建術及相關輔助性治療的廣泛推廣使用，大大降低了AMI患者的病死率[3]。然而，臨床上AMI病死率的控制，對其并發心臟破裂(cardiac rupture，CR)的預后及病死率并沒有顯著改善。CR是AMI臨床上較為嚴重的常見并發癥，常在AMI病發7 d內出現，病發急驟，先兆癥狀相對較少，好發于合并有梗死性高血壓、初發、女性、高齡、心肌再灌注延遲及左心室透壁性梗死患者[4]。臨床上按照CR的病死率及發生部位將其分為乳頭肌斷裂、室間隔穿孔、游離壁破裂三種類型。其中最常見的為心室游離壁破裂，一旦病發，往往會導致患者急性心包填塞的出現，可短時間內死亡，難以搶救，另外，臨床資料[5]顯示，并發CR的AMI患者在引起心源性猝死方面僅次于心源性休克，死亡率約占AMI患者病死率的30%。GDF-15是一種患者凝血狀態及血管內皮損傷發生改變的敏感標志物，另外，研究[6]表明，AMI患者并發CR與其ECM蛋白、輔助性分子及GDF-15關系密切。故本文探討AMI并發CR患者與ECM蛋白、ECM輔助性分子以及GDF-15的相關性分析，為AMI并發CR患者的臨床診治以及預防提供參考。

1 資料與方法

1.1一般資料 回顧性分析我院2016年2月至2018年3月收治的265例AMI患者的臨床資料，根據患者是否并發CR將其分為對照組(AMI患者230例)和觀察組(AMI并發CR患者35例)。對照組中男65例，女165例；年齡51～85歲，平均(63.21±5.67)歲； 體質量指數(BMI)平均(22.67±1.20) kg/m2；梗死部位：前壁147例，非前壁83例；吸煙史105例，高血壓121例，糖尿病64例，高血脂43例。觀察組中男10例，女25例；年齡50～85歲，平均(63.25±5.71)歲；BMI平均(22.62±1.24) kg/m2；梗死部位：前壁22例，非前壁13例；吸煙史15例，高血壓18例，糖尿病10例，高血脂7例；患者心臟破裂類型乳頭肌斷裂2例，室間隔穿孔10例，游離壁破裂23例。AMI診斷標準：參考WHO制定的AMI診斷標準的相關規定[7]，具體如下：(1)病史：患者有出現≥0.5 h較為嚴重的典型胸痛病史。(2)心電圖：常規心電圖檢測顯示，患者出現諸如持久的QS波、Q波、對稱性倒置的T波、演進性的損傷電流、靜止性的損傷電流、電流傳導性障礙等異常心電圖。(3)血清酶：心肌酶、肌鈣蛋白等相關血清酶出現先升高后降低的序列性變化。滿足上述三個項目中的任何兩項即可診斷為AMI。CR診斷標準[8]：(1)乳頭肌斷裂診斷標準：X線胸片肺水腫或肺淤血；二尖瓣區雜音加重或者有新的雜音出現，當患者升高左心房壓力時，其雜音減輕，血液動力學出現突然轉變；超聲可以對二尖瓣反流進行定量或者診斷。(2)室間隔穿孔診斷標準：有心室水平分流及室間隔連續性中斷出現，多普勒超聲可對左向右分流嚴重程度及室間隔缺損進行評估定位。(3)游離壁破裂診斷標準：患者表現為伴有電機械分離(持續性電活動，但沒有脈搏及心排血量出現)的“循環”崩潰，并有較為典型的心臟壓塞體征，多普勒超聲檢查有心包腔血栓以及心包積液性超聲致密性陰影出現。納入標準：(1)對照組患者符合AMI診斷標準，觀察組在符合上述診斷的基礎上，滿足CR診斷標準；(2)此研究經本院醫學倫理委員會批準；(3)患者及家屬同意并積極配合本次研究，簽署知情協議書。排除標準：(1)合并有嚴重的心肝腎肺功能障礙者；(2)合并有阿爾茨海默病、自身免疫性疾病、腎病綜合征以及惡性腫瘤等者；(3)近期接受外科手術以及急性創傷者；(4)近期嚴重感染者；(5)妊娠哺乳期患者；(6)依從性差，中途退出者。兩組患者在年齡、性別、BMI指數、梗死部位以及合并癥等一般資料方面比較，差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2方法 (1)血清GDF-5、白細胞介素-1(IL-1)、白細胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)水平測定：對于所有受試者，隔夜空腹時間≥8 h，并于其次日清晨8點左右抽取肘部空腹靜脈血，在室溫條件下靜置30 min，通過離心機(Ortho BioVue；強生(上海)醫療器材有限公司)在離心半徑為10.5 cm、轉速3 000 r/min條件下，離心10 min，取其上清液，冰箱-75℃保存，待測。采用酶聯免疫吸附法(ELISA)對血清GDF-5、IL-1、IL-6及TNF-α水平進行測定，試劑盒購于上海瑤韻生物科技有限公司，操作方法嚴格按照說明書執行。(2)血清基質金屬蛋白酶-2(MMP-2)、基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)水平測定：采用ELISA法進行測定，試劑盒購于上海江萊生物科技有限公司。操作方法嚴格按照說明書執行。(3)ECM蛋白(Ⅲ型膠原、Ⅳ型膠原)以及ECM輔助性分子(粘連蛋白)免疫組化法[9]：試劑盒采用購于武漢博士德生物有限公司的SP試劑盒，操作方法如下：將石臘片切成切片(4 μm)，在60℃條件下烘烤1 h，再采用二甲苯對上述切片進行浸泡5 min及脫蠟處理2次，將配置好的100%、95%、85%、75%的酒精依次加入其中，分別進行水化1 min，自來水沖洗2 min及蒸餾水沖洗2 min；3%雙氧水環境下，孵育處理10 min，對內源性過氧化物酶的活性進行消除處理，之后用雙蒸水沖洗，再用0.01MPBS進行漂洗處理5 min；把胃蛋白酶(0.4%)加入到Ⅳ型膠原染色的切片中，胰蛋白酶(0.1%)加入到粘連蛋白、Ⅲ型膠原切片中，37℃條件下，孵育20 min，再進行3次PBS(0.01M)的漂洗；每片切片再加入30 μL封閉用的山羊血清(10%)，37℃條件下，孵育25 min，30 μL層粘連蛋白和Ⅳ型膠原抗體加入胰蛋白酶處理的切片，30 μL Ⅳ型膠原抗體加入胃蛋白酶處理的切片，冰箱4℃條件下過夜；之后再進行3次PBS(0.01M)震蕩漂洗5 min，將被通用型生物素標記的30 μL小鼠、大鼠、豚鼠、羊抗兔IgG抗體分別加入上述切片中，37℃條件下，孵育25 min；之后再進行3次PBS(0.01M)震蕩漂洗5 min，再將30 μL的鏈霉卵白素(辣根過氧化物酶標記)，37℃條件下，孵育25 min；之后再進行3次PBS(0.01M)震蕩漂洗5 min，DAB-H2O2(0.01%)顯色，自來水沖洗，復染采用Harris蘇木素，再采用1%鹽酸酒精進行分化，自來水沖洗，將配置好的100%、95%、85%、75%的酒精依次加入其中，脫水處理，透明二甲苯中性樹膠封片。最后通過醫學圖像分析系統掃描(北京科電創藝電子技術有限公司)進行分析，計算積分光密度值(IOD)。

2 結 果

2.1兩組患者血清GDF-5水平及Ⅲ型膠原、Ⅳ型膠原、粘連蛋白IOD值比較 觀察組患者的血清GDF-5水平以及Ⅲ型膠原、Ⅳ型膠原、粘連蛋白IOD值明顯高于對照組(P<0.05)。見表1。

表1 兩組患者血清GDF-5水平及Ⅲ型膠原、Ⅳ型膠原、粘連蛋白IOD值比較

2.2AMI并發CR與血清GDF-5水平及Ⅲ型膠原、Ⅳ型膠原、粘連蛋白的相關性分析 AMI并發CR與血清GDF-5水平及Ⅲ型膠原、Ⅳ型膠原、粘連蛋白均呈正相關(P<0.05)。見表2。

表2 AMI并發CR與血清GDF-5水平及Ⅲ型膠原、Ⅳ型膠原、粘連蛋白的相關性分析

2.3兩組患者血清基質金屬蛋白酶水平比較 觀察組患者的血清MMP-2和MMP-3水平明顯高于對照組(P<0.05)。見表3。

表3 兩組患者血清基質金屬蛋白酶水平比較

2.4兩組患者血清炎癥因子水平比較 觀察組患者的血清IL-1、IL-6以及TNF-α水平明顯高于對照組(P<0.05)。見表4。

表4 兩組患者血清炎癥因子水平比較

3 討 論

近年來AMI的病發率和死亡率居高不下，給患者及家屬帶來了嚴重的生活及經濟負擔，主要是由于AMI并發癥較多，治療生存率及預后改善情況較差，介入手術的相關治療費用較為昂貴。另外，目前臨床上急診內科評分、慢性健康與急性生理學評分及急性冠狀動脈事件注冊等相關評分系統雖然可以綜合評估其近期的死亡風險，但并不能有效評估AMI患者并發惡性心律失常及CR等情況[10]。而目前臨床上AMI患者大部分的致死因素為CR、惡性心律失常及急性心衰等，其中惡性心律失常以及急性心衰患者如果能夠給予及時的治療措施，可以一定程度降低AMI患者的死亡率[11]。對于AMI并發CR患者，其發病機制與基質金屬蛋白酶致心肌重塑缺陷、神經內分泌激活、腎素-血管緊張素系統激活、細胞調亡、基因易感性有關[12]。臨床上及時給予外科手術或者內科相關保守治療，雖然具有一定的效果，但是并不能有效的改變疾病最終結局，故對于AMI并發CR的提前預防診斷顯得尤為重要。

GDF-15作為轉化生長因子-β家族的重要成員之一，其表達具有一定的組織特異性，正常情況下，在胰臟、腎臟中可被檢測到表達，在前列腺及胎盤中呈現高表達，在心臟等其他器官組織中幾乎難以檢測到表達量[13]。心肌細胞在心力衰竭、心臟高壓力負荷、動脈粥樣硬化及缺血再灌注損傷等相關心血管疾病的誘導下，可對GDF-15一定程度高表達。另外，其可通過脂多糖對體內的巨噬細胞及心肌細胞產生刺激，誘導TNF-α的合成分泌[14]。TNF-α基因敲除試驗[15]顯示，小鼠CR的發生率和病死率明顯降低，同時其白細胞的浸潤程度相對降低，造成體內白細胞介素相關分子及基質金屬蛋白酶含量降低，TNF-α可通過GDF-15參與AMI合并CR的發生，提高患者的病死率，與文中TNF-α研究結果一致。而GDF-15可以對整合素及趨勢因子信號進行直接干擾，阻止白細胞聚集的發生，引發AMI后出現CR。Ⅲ型膠原、Ⅳ型膠原可以與二聚糖進行特異性結合，并對相應膠原纖維、二重螺旋膠原分子組裝進行控制，其對于在ECM膠原網中作用重大。小鼠Ⅲ、Ⅳ型膠原基因敲除試驗后21 d，其CR的病死率和發病率倍數增加，其主要是通過MMP-2和MMP-3等相關基質金屬蛋白酶的血清含量升高，增強對心肌細胞基質的降解能力，進而降低膠原含量和左心室的抗張強度，ECM膠原網結構破壞變薄，最終導致AMI患者左心室擴大，并發嚴重功能性障礙[16]。粘連蛋白是一種重要的ECM輔助性分子，其對于ECM膠原網組織結構的完整性沒有直接性的影響，但是可以通過對AMI患者心肌細胞膠原合成、生長因子、細胞外蛋白酶及ECM的相互作用進行調節，進而對ECM的相關代謝進行控制[17]。研究顯示，AMI合并CR患者出現混亂的紅細胞浸潤，小而不規則膠原以及膠原纖維含量較少，粘連蛋白含量較高。與文中相關性研究結果一致。

綜上所述，AMI合并CR患者ECM蛋白、ECM輔助性分子及GDF-15均明顯升高，可以為AMI患者并發CR的提前預防診斷提供參考。