外周血中clusterin和septin-9及CA125在卵巢癌患者中的表達及其意義

郭艷紅 鐘惠敏 周龍書

(廣州醫科大學附屬第二醫院婦科，廣東 廣州 510000)

卵巢癌是一種惡性程度高、治療難度大的婦科腫瘤。受卵巢在體內所處的位置及卵巢癌的生物學特性的影響，卵巢癌的早期診斷比較困難[1]。因而，尋找卵巢癌早期發病的相關指標，對疾病的早期診治及患者的預后有著積極意義。新近發現，clusterin和septin-9蛋白可能與卵巢癌的發病存在一定的相關性。其中，clusterin蛋白是一種抗凋亡蛋白，在多種器官和組織中均有表達。目前已發現，clusterin蛋白的高表達與肺癌、乳腺癌等有關[2]。編碼septin-9蛋白的septin-9基因位于染色體17q25.3，亦被稱之為ovarian/breast(Ov/Br)septin基因，目前認為其發揮了原癌基因的作用[3]。CA125是一項臨床常用的腫瘤指標，對消化系統及婦科等腫瘤具有較高的敏感性。筆者擬在傳統腫瘤指標CA125基礎上聯合clusterin和septin-9基因/蛋白的檢測，以分析其與卵巢癌患者早期診斷及預后判斷的相關性。現報告如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇我院婦產科2016年5月至2018年1月收治的明確診斷為卵巢癌的患者62例為觀察組。另選擇同期健康體檢者31例為對照組。觀察組年齡35～48歲，平均(41.25±6.28)歲；FIGO分級Ⅰ～Ⅱ期的患者共33例；Ⅲ～Ⅳ期的患者29例；其中未分化者5例，低分化者28例，中分化者10例，高分化者19例；發生遠處轉移者22例，無遠處轉移者40例，發生淋巴結轉移者21例，未發生淋巴結轉移者41例。對照組年齡35～49歲，平均(41.62±6.64)歲。納入標準：經病理證實為卵巢癌并采用國際婦產科聯合會(FIGO)分期；未接受化療、放療及生物治療等；預計生存期≥6個月。排除標準：卵巢轉移性癌；合并其他系統惡性腫瘤者。兩組患者基線資料間未見明顯差異(P>0.05)，具有可比性。

1.2試劑與方法

1.2.1試驗試劑及儀器 試劑：Trizol試劑(購自美國Invitrogen公司)、RNA提取試劑盒(購自德國Miltenyi Biotec公司)、逆轉錄和PCR試劑盒(均購自美國 Invitrogen 公司)、引物合成(上海生工公司)、人clusterin ELISA試劑盒(購自美國LIFEKEY公司)、人septin-9 ELISA試劑盒(購自美國ABNOVA公司)、CA125采用化學發光法檢測。儀器：ABI 7300型實時定量熒光PCR儀。

1.2.2方法 (1)抽取患者外周血于4℃條件下，1 500 g離心力下離心15 min，取上層血漿分裝保存于-80℃冰箱以備用。(2)采用qRT-PCR方法檢測基因表達水平采用TRIZOL試劑提取總RNA。采用逆轉錄試劑盒合成cDNA。以β-catin為內參基因，采用ABI 7 300型PCR儀將轉錄成的cDNA在50℃、2 min，95℃、15 min，95℃、15 s，60℃、1 min，共40個循環條件下擴增。每次循環均設空白對照，計算目的基因 mRNA的相對表達量，每組重復 3 次取均值。PCR產物采用2%瓊脂糖凝膠電泳分析并鑒定。基因相對表達量采用△△Ct法進行計算，△△Ct=(Ct目的基因-Ctβ-catin)觀察組-(Ct目的基因-Ctβ-catin)對照組，觀察組標本相對表達量為2-△△Ct。引物序列見表1。(3)按照ELISA試劑盒說明書，分別檢測血漿中clusterin和septin-9蛋白水平。

表1 引物序列

2 結 果

2.1兩組患者clusterin和septin-9 mRNA表達水平比較 經過檢測顯示，觀察組患者外周血中clusterin和septin-9 mRNA相對表達量分別為(1.67±0.81)、(1.93±0.22)；外周血中clusterin和septin-9 蛋白相對表達量分別為(133.26±16.31)、(633.29±28.61)。與對照組相比，觀察組患者外周血中clusterin和septin-9 Mrna/蛋白表達量均顯著升高，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.2兩組患者外周血CA125表達水平比較 與對照組(37.91±11.84) kU/mL相比，觀察組患者外周血中CA125表達量(279.36±36.14) kU/mL顯著升高(t=5.338，P=0.011<0.05)。

2.3外周血clusterin、septin-9及CA125表達水平與疾病相關性 分別比較不同病理分期、是否遠處轉移(包括淋巴結轉移)及不同分化程度患者間clusterin、septin-9及CA125表達水平發現：Ⅰ～Ⅱ期卵巢癌患者與Ⅲ～Ⅳ期卵巢癌患者相比，clusterin基因/蛋白及CA125水平顯著降低(P<0.05)，而septin-9基因/蛋白表達水平間未見明顯差異；未發生遠處轉移(包括淋巴結轉移)者較發生遠處轉移(包括淋巴結轉移)者，其septin-9基因/蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)，而clusterin基因/蛋白及CA125間未見明顯差異；不同分化程度患者間clusterin、septin-9及CA125表達水平均未見明顯差異。見表2。

表2 不同病理分期、是否遠處轉移及不同分化程度患者間clusterin、septin-9及CA125表達水平差異

3 討 論

卵巢癌是婦女第五常見的惡性腫瘤。卵巢惡性腫瘤死亡率居高不下的原因主要在于約占卵巢原發惡性腫瘤總數80%～90%的卵巢上皮性癌在早期時癥狀不明顯，沒有有效的早期篩查手段，臨床上早期難以發現，發現時常常已經是晚期，而晚期卵巢癌即使經過規范化治療，在治療后3年內多數仍會出現復發、轉移和耐藥，患者預后很差，5年生存率僅為20%左右[4-6]。因此，尋找早期的診斷指標對卵巢癌患者的診斷、治療及遠期預后具有重要意義。傳統的腫瘤指標主要包括糖類蛋白等，其中CA125對消化系統及婦科系統來源腫瘤具有較高的他特異性，但在疾病早期缺乏敏感。相關指標明顯升高時，往往原發病已顯著進展。因而，單純依靠現有的腫瘤監測指標遠不能滿足包括卵巢癌在內的惡性腫瘤性疾病的診治需求。

septin-9定位于染色體17q25.3，是體內重要的原癌基因之一[7]。體外研究[8-9]發現，在人細胞系的AffymetrixHG U133基因芯片檢測結果表明，septin-9在乳腺、中樞神經系統、子宮內膜、腎臟、肝、肺、淋巴、食管、卵巢、胰腺、軟組織、皮膚、甲狀腺等來源的腫瘤中高表達。clusterin基因定位于染色體8p21-p12，其編碼的蛋白參與了多種重要生理功能，包括精子成熟、膜再生、脂類轉運、組織分化和重塑、補體抑制、細胞．細胞及細胞．細胞外基質相互作用、炎癥、細胞運動、分子伴侶、細胞氧化應激、細胞增殖、細胞凋亡等[10-15]。近年來研究[16-18]發現，clusterin除作為胞外分子伴侶發揮使應激性蛋白變穩定的作用外，也是一種凋亡相關蛋白，參與到細胞程序化死亡過程中，該蛋白在腫瘤性疾病的發生、發展過程中可能起到一定的促進作用。然而有關septin-9/clusterin基因及其轉錄的蛋白水平與卵巢癌發生及進展過程是否相關，相關報道較少。本組資料中，在觀察組患者中septin-9及clusterin基因/蛋白表達的水平較對照組顯著升高，提示這兩種基因/蛋白可能參與了卵巢癌發病過程，在進一步的分析中發現，病理分期晚期的患者中，其clusterin基因/蛋白及CA125表達水平較早期患者顯著升高，提示clusterin聯合CA125檢測對早期卵巢癌的診斷具有一定的意義。而通過對原發腫瘤轉移情況分析發現，septin-9基因/蛋白在發生遠處轉移的患者中明顯升高，這表明septin-9的高表達可協助提供腫瘤進展的證據。

綜上所述，卵巢癌患者外周血中clusterin、septin-9及CA125水平較正常人群均顯著升高，其中clusterin和CA125表達增高者可能提示病理分期較高，septin-9表達增高考慮存在原發病的遠處轉移可能。然而，受到樣本量等客觀因素的限制，數據偏倚在所難免，相關因素的長期作用尚需進一步研究。