華蟾素注射液干預血管內皮細胞和腫瘤細胞增殖及VEGF表達的實驗研究

胡 葉 周 琴 李善君 馮寶約 楊 瑩 左明煥

腫瘤生長與轉移有賴于血管生成。血管生成是一個多因素參與、多步驟復雜的過程，它與腫瘤細胞、血管內皮細胞均密切相關[1]。VEGFR-2做為VEGF受體，主要與調控血管生成有關。VEGF/VEGFR-2構成調控腫瘤血管生成的關鍵信號傳導途徑[2]。

華蟾素注射液是由中華大蟾蜍陰干的全皮中提取制成的水溶性注射液。實驗研究表明，華蟾素具有提高患者免疫力、抑制腫瘤細胞生長等功能[3]。本文通過四甲基偶氮唑鹽(MTT)實驗、倒置熒光顯微鏡實時成像技術和酶聯免疫(ELISA)實驗，對比觀察華蟾素注射液對血管內皮細胞和腫瘤細胞生長狀況和VEGF表達的影響，探討華蟾素注射液抑制惡性腫瘤血管生成的可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞株

人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)一株，購自ATCC細胞庫。HUVEC使用Endothelial cell medium(ECM)完全培養基(內含 5% 胎牛血清、10 μl/ml ECGS、100 U/ml 青霉素、100 μg/ml 鏈霉素)。人結腸癌SW480細胞系購于中國科學院細胞庫。SW480細胞使用DMEM完全培養基內含(10% 胎牛血清、100 U/ml 青霉素、100 μg/ml 鏈霉素)。在37 ℃、5%CO2培養箱中培養，細胞經胰酶消化、傳代和收獲，取對數生長期細胞用于研究。包裝細胞PT-67 RFP，包裝細胞PT-67 H2b GFP 由安泰康生物技術有限公司構建提供。

1.2 藥品和試劑

華蟾素注射液(5 ml，500 mg/ml)購自安徽華潤金蟾有限公司，用時使用對應細胞完全培養基稀釋至所需濃度。Endothelial cell medium(ECM)培養基套裝購自ScienCell，PBS購自CORNING公司，0.05%胰酶、胎牛血清購自Gibco公司，DMSO、MTT購自Amresco公司，Geneticin(G418 Sulfate)購自Gibco，Hygromycin B購自Invitrogen，Human VEGF HUMAN ELISA Kit 購自eBioscience公司，Human VEGFR-2 Elisa BMS2019 購自eBioscience公司。

1.3 MTT法檢測細胞增殖抑制率

取對數生長期的細胞，胰酶消化后進行細胞計數，以4×103個/孔接種于96孔板中，用培養液定容至總體積200 μl，細胞貼壁后更換培養基，加入待測藥物，分為空白對照組、華蟾素組，每個濃度設置6個平行復孔，分別于加藥后24 h、48 h、72 h進行MTT 檢測，每孔加入20 μl的MTT溶液，CO2培養箱孵育4 h后，去上清，加入100 μl/孔DMSO溶液，充分溶解后，在酶標儀上測定570 nm處的OD值。

1.4 倒置熒光顯微鏡觀察細胞凋亡的形態學變化

1.4.1 雙色熒光細胞的轉染與篩選 穩定轉染雙色熒光細胞，即細胞核穩定表達綠色熒光蛋白(GFP，green fluorescent protein)，細胞質穩定表達紅色熒光蛋白(RFP，red fluorescent protein)，是通過將綠色熒光蛋白特異性轉入已有的表達RFP細胞的細胞核中進行穩定表達。將包裝細胞 PT-67 H2b RFP 培養至對數期，收集培養4 h的新鮮上清液，0.22 μm濾膜過濾后，分別對兩種細胞進行2～4次轉染，48～72 h后可見部分細胞質表達紅色熒光蛋白，用50、100、200 μg/ml潮霉素B及400、800、1 000 μg/ml的G418進行篩選。1～2周后選取雙色細胞比例大，細胞狀態好的組進行單克隆篩選，以1 cell/孔接種96孔板，1周后尋找有單克隆形成的孔，待細胞數量>200 cell時，進行消化擴培，選取熒光最亮的克隆保種得到HUVE RFP和SW480 RFP。然后將對數期的包裝細胞PT-67 H2b GFP收集上清并過濾，分別對HUVE RFP和SW480 RFP進行轉染，轉染、篩選及單克隆方法同上，最終得到雙色熒光轉染的HUVEC細胞(HUVEC DUAL)和雙色熒光轉染的SW480細胞(SW480 DUAL)。

1.4.2 熒光顯微鏡下形態學觀察 將雙色熒光細胞培養至對數期，0.05%胰酶消化收集細胞并計數，以細胞數4×103cell/孔體積200 μl接種于96孔細胞培養板，貼壁過夜后上樣，分別設置空白對照組及華蟾素組，每個濃度設3個平行孔，CO2培養箱孵育0，24 h，48 h，倒置熒光顯微鏡進行成像，觀察細胞形態。

1.5 酶聯免疫法(Elisa)檢測 VEGF、VEGFR-2 表達

1.5.1 Elisa法檢測VEGF表達 取空白對照組及華蟾素組干預48 h后的細胞上清液，1 000 r/min 離心20 min再取上清，嚴格按照VEGF HUMAN ELISA Kit試劑盒說明操作，將不同濃度的VEGF標準品以及不同組的細胞上清液于酶標儀中檢測450 nm吸光度值和上清中VEGF吸光度值，計算VEGF含量。

1.5.2 Elisa法檢測VEGFR-2表達 將空白組及華蟾素組干預48 h后的細胞上清棄掉，加細胞裂解液，離心后取上清，按照Human VEGFR-2 Elisa BMS2019說明操作，將不同濃度的VEGFR-2標準品以及不同組的細胞上清液于酶標儀中檢測450 nm吸光度值和上清中VEGFR-2吸光度值，計算VEGFR-2含量。

1.6 統計學方法

2 結果

2.1 華蟾素注射液對HUVEC細胞增殖的影響

3個濃度的華蟾素組與對照組相比，培養24 h OD值均無明顯差異，培養48 h后有3組OD值低于正常對照組(P<0.05)，72 h后華蟾素的抑制作用減弱，僅2組低于對照組(P<0.05)。表明在實驗濃度范圍內，培養24 h 華蟾素對正常內皮細胞的生長無明顯作用，48 h表現出對HUVEC的最大抑制作用，72 h時抑制作用減弱，見表1。

2.2 華蟾素注射液對SW480細胞增殖的影響

MTT法結果顯示，華蟾素能顯著抑制 SW480 細胞的生長增殖能力，且呈一定的量效與時效關系。作用24、48及72 h后，高劑量華蟾素濃度組與空白對照組有統計學差異?？梢娝幬餄舛仍礁?，作用時間越長，華蟾素對SW480細胞的抑制作用越強(表2)。

表1 華蟾素處理HUVEC細胞的 OD值

注：*為與空白對照組同期相比，P<0.05；**為與空白對照組同期相比，P<0.01。

表2 華蟾素處理HUVEC細胞的 OD值

注：*為與空白對照組同期相比，P<0.05；**為與空白對照組同期相比，P<0.01。

2.3 不同濃度的華蟾素干預HUVEC細胞形態對比

隨著華蟾素濃度的增高和時間的延長，內皮細胞的增殖受到抑制，但未見明顯的細胞核異常，沒有明顯誘導內皮細胞凋亡的作用。

2.4 不同濃度的華蟾素干預SW480細胞形態對比

華蟾素對人結腸癌細胞SW480有明顯的增殖抑制、誘發凋亡的作用，并且隨著時間延長和濃度增加，抑制增殖和促進凋亡的作用越強。

2.5 HUVEC細胞中VEGF及其受體含量變化

通過VEGF Elisa試劑盒測定華蟾素組(0.01 mg/ml、0.1 mg/ml、1 mg/ml)實驗表明不同濃度的華蟾素注射液不能抑制HUVEC細胞分泌的VEGF，各濃度組間無統計學差異。而HUVEC細胞膜表面VEGFR-2在華蟾素作用下降低，降低差異有明顯統計學意義，說明華蟾素呈濃度依賴性抑制HUVEC細胞表面的VEGFR-2，但對細胞表達的VEGF無影響，見表3。

表3 華蟾素干預HUVEC細胞48 h后VEGF及VEGFR-2表達情況

注：*為與空白對照組同期相比，P<0.05；**為與空白對照組同期相比，P<0.01；△為與華蟾素其他濃度組同期相比，P<0.01。

2.6 SW480細胞中VEGF及其受體含量變化

通過VEGF Elisa試劑盒測定華蟾素組(1 mg/ml、10 mg/ml、100 mg/ml)作用48 h后VEGF蛋白的表達量分別是：(271.10±0.32)pg/ml，(240.99±18.63)pg/ml，(207.76±18.97)pg/ml，與空白對照組(285.65±31.12)pg/ml相比，差異有統計學意義(P<0.05)。VEGFR-2在不同濃度華蟾素注射液的變化趨勢與VEGF相似。說明華蟾素呈濃度依賴性抑制 SW480 細胞表達VEGF及VEGFR-2，見表4。

3 討論

惡性腫瘤生長與轉移有賴于血管生成，惡性腫瘤血管在細胞組成、組織結構及功能特點上與正常血管有明顯差異。例如，腫瘤血管管壁并非由單一的內皮細胞層構成，單純腫瘤細胞或腫瘤細胞與內皮細胞之間均可形成血管壁內層細胞。此外，研究表明，抑制正常組織血管生成的調控機制并不能控制腫瘤血管生成[4]。

華蟾素是1種具有抗腫瘤作用的傳統中藥，在臨床中得到了廣泛應用[3]。 袁莉等[5]分析102例接受華蟾素灌注的惡性腹水患者，有效率為65.7%，并顯示華蟾素能使惡性腹水顏色由紅色轉為淡黃色。左明煥等[6]對濕熱型惡性腹水患者60例進行研究，結果華贍素腔內灌注組優于白介素-2腹腔灌注組。孫韜等[7-8]使用華蟾素注射液灌注治療晚期肺癌惡性心包積液可有效控制其增長，毒副作用小，可耐受，一定程度上能夠改善患者的生活質量并延長生存。劉傳波等[9]發現華蟾素膀胱灌注聯合血凝酶可有效控制膀胱癌血尿，減少膀胱出血，改善患者生活質量。可見，華蟾素在機體體內能夠有效抑制惡性腫瘤血管的產生和增殖。

表4 華蟾素作用SW480細胞48h后VEGF及VEGFR-2表達情況

注：*為與空白對照組同期相比，P<0.05；**為與空白對照組同期相比，P<0.01。

本研究通過體外實驗，觀察腫瘤細胞和血管內皮細胞在華蟾素注射液干預下的細胞生長抑制情況時發現，在有效治療劑量范圍內，華蟾素能夠有效抑制腫瘤細胞生長、誘導腫瘤細胞凋亡；對于正常血管內皮細胞，華蟾素的作用僅表現為一過性的抑制，同時不能誘導內皮細胞的凋亡。VEGF及其受體表達方面，華蟾素有效降低腫瘤細胞表達VEGF蛋白含量，且該抑制作用呈量效性和實效性；同時華蟾素能夠抑制正常血管內皮細胞膜VEGFR-2受體的表達，但對血管內皮細胞表達的VEGF無明顯抑制作用。由此，課題組推斷華蟾素能夠選擇性作用于腫瘤細胞及惡性腫瘤血管，抑制其生長和增殖，同時不會引起正常血管細胞的損傷，是一種潛在抗腫瘤血管生成的藥物，其作用機理可能是阻斷了腫瘤細胞所表達VEGF與正常內皮細胞膜表面的VEGFR-2受體結合，抑制腫瘤新生血管生成。

目前，用于腫瘤治療的藥物大多數缺乏腫瘤細胞靶向性，在殺傷腫瘤細胞的同時，也殺傷大量骨髓及其他正常的增殖旺盛細胞，產生嚴重的不良事件，使病人難以承受?，F臨床常用的抗腫瘤血管藥物作用機理多為干擾或阻斷單一1個因子涉及的途徑，雖然可以抑制腫瘤的血管生成，但容易誘發腫瘤援救反應，難以達到令人滿意的治療效果[10]。華蟾素作為中藥制劑，能夠多靶點、多系統的對抗惡性腫瘤血管的生成和增殖，其療效顯著，毒副作用小，耐受性強，適于臨床推廣，其抗腫瘤血管生成的機理仍需進一步研究和完善。