乳腺癌中GRB7與HER2表達的相關性研究

王 潔 周 兵

HER2(人類表皮生長因子受體蛋白2)在的浸潤性導管癌中陽性表達，已經成為曲妥珠單抗的治療靶點，并已廣泛應用于臨床，但因費用昂貴和心臟毒性等副作用一直在存在較大的爭議[1]。因此，尋找乳腺癌新的治療靶點正成為熱點，GRB7(生長因子受體結合蛋白-7基因)作為與HER2一樣同時位于17號染色體長臂上的1區2帶-2區1帶(17q12-21)的基因位點，被認為與乳腺癌的發生、發展存在密切的相關性。而在乳腺癌中有關于GRB7與HER2的關系國外研究得較少，國內鮮見相關報道[2]。現本文通過IHC與FISH法檢測乳腺癌患者GRB7蛋白與HER2基因及蛋白表達，并探討它們之間的相關性，為今后的乳腺癌患者治療選擇合適的個體化治療方案提供分子理論依據。

1 材料與方法

1.1 標本收集

選取九江市第一人民醫院病理科2011年6月到2016年6月間，未經放化療的乳腺浸潤性導管癌存檔組織標本110例為實驗組，均為女性患者，年齡22～61歲，平均(44.2±2.7)歲。同時隨機選取20例實驗組的癌旁正常乳腺組織設為對照組。選取的對照組為實驗組癌旁組織，存在可比性。

1.2 試劑及方法

IHC檢測。GRB7鼠抗人單克隆抗體(工作濃度1:100)購于艾博康上海貿易有限公司。Her2為北京中衫金橋生物有限公司產品。所有乳腺癌蠟塊標本均為臨床、影像及高年資病理醫生確診，常規石蠟4 μm切片，按試劑盒說明逐步SP法免疫組化染色，實驗組及對照組均采用同種處理方法，用PBS 液替代一抗作陰性對照，最后常規鏡檢。

FISH檢測。HER2基因的檢測試劑盒購自于北京金菩嘉公司，所有操作按照試劑盒步驟，白片組織脫蠟、脫二甲苯后，胃蛋白酶孵育15 min，再次洗滌、干燥后，加入10 μl探針，雜交儀中37 ℃過夜，72 ℃暗室干燥，加入10 μl DAPI顯色液。正常乳腺組織和對照片同時作為陰陽對照，熒光顯微鏡鏡檢。

1.3 結果的判斷

免疫組化判斷依據美國臨床腫瘤學會ASCO分級對HER2和GRB7行結果判讀。HER2陽性呈棕黃色定位于包膜：腫瘤細胞膜染色占比≤10%、微弱不完整膜染色占比≥10%、弱完整膜染色占比≥10%、強完整膜陽性占比≥10%，分別計數(0～3+)。GRB7陽性呈棕黃色定位于包膜或胞質：腫瘤細胞染色陽性占比<5%、5%～25%、26%～50%、>50%，分別計數(0～3+)。

FISH結果判斷依據美國臨床腫瘤學會ASCO的HER2檢測指南，根據試劑盒DNA探針說明，綠色信號為17號染色體絲粒(CEP17)，紅色信號為HER2基因。隨機計數30個腫瘤細胞，HER2/CEP17信號比≥2被認為陽性，即HER2基因存在擴增； HER2/CEP17信號比<2為陰性，HER2基因無擴增。

1.4 統計學方法

所有數據應用SPSS 18.0統計軟件處理并行相關性分析，P<0.05認為統計學意義。

2 結果

2.1 HER2蛋白表達水平及基因擴增情況

免疫組化檢測乳腺癌HER2表達評分0～1、2+和3+的病例占比分別為49.1%(54/110)、23.6%(26/110)和27.3%(30/110)，正常乳腺組織HER2不表達；FISH檢測共計36例乳腺癌病例出現基因擴增,74例未擴增，與免疫組化HER2評分0～1、2+和3+符合率分別為0、30.8%和93.3%。HER2的免疫組化及FISH檢測結構存在正相關性，相關系數γ=0.78(P<0.05)(表1)。

表1 HER2表達和擴增情況及相關性/例

2.2 GRB7蛋白表達及與HER2的相關性

110例乳腺癌標本中免疫組化方法檢測GRB7表達評分0～1和2～3+的病例占比分別為51.8%(57/110)和48.2%(53/110)，正常乳腺組織表達1例占比為5%(1/20)。Her2表達與GRB7表達存在強相關性 (γ=0.83，P<0.05)(表2)。

表2 乳腺癌中HER2和GRB7表達的相關性/例

3 討論

乳腺癌治療主要以傳統的手術、放化療、內分泌治療為主，近年來已明確了曲妥珠單抗為HER2+乳腺癌患者的治療靶點，聯合輔助化療可以明顯提高her2陽性乳腺癌的療效[3]。但是未擴增的17號染色體HER2陰性，及轉移性血清HER2陽性的乳腺癌患者預后仍不佳[4-5]，因此，針對乳腺癌細胞生物學特點與乳腺癌治療及預后判定的靶點治療成為當今乳腺癌研究的熱點[6]。具有療效好，毒副反應小的特點，能大大的提高病人的生活質量，降低死亡率。給目前乳腺癌的治療提供了1個很好的方向。而乳腺癌的發生被證明與人類17號染色體存在密切關系。17號染色體由8100萬個堿基構成，含有1500個基因片段，其DNA編碼存在多片段重復性，參與了多種蛋白表達及基因編碼[7]。尤其在位于17號染色體長臂上的1區2帶-2區1帶(17q12-21)的基因位點最為密集，有多個與乳腺癌表達相關的基因位點(HER2、GRB7、TOP2A、RARA、LASP1、STARD3等)，被認為與乳腺癌的發生、發展存在密切的相關性[8]。HER2為目前研究的比較透徹的一類具有酪氨酸激酶活性的高同源性蛋白質，由結合區和胞內區組成。分子量約為185KD，包含23個氨基酸。被認為能促進腫瘤細胞增殖、抑制腫瘤細胞凋亡；并能通過上調(VEGF)/(VPF)削弱機體屏障，促進腫瘤內新生血管生長，從而增加惡性腫瘤的侵襲力[9]。GRB7(為最近發現的一類編碼的多域的接頭蛋白,含有535個氨基酸殘基,有3種功能區域分別為富含脯氨酸的功能區N端、中間的GM區和位于C末端的SH2結構域[10]。人體內Grb7在胰腺中高表達，認為Grb7廣泛參與表皮生長因子、成纖維細胞生長因子受體和胰島素信號轉導等各種信號轉導通路，研究發現在很多腫瘤組織中，尤其是在侵襲的乳腺癌中GRB7蛋白處于高表達狀態，其蛋白域相互作用及功能特異性有希望成為乳腺癌新的化療靶點[11]。

本研究通過免疫組化方法測定110例HER2和GRB7蛋白表達狀態，并應用FISH檢測HER2 基因擴增的情況并初步探討兩者之間的關系。發現HER2免疫組化2+、3+陽性表達率占所有乳腺癌檢查的50.9%，而GRB7免疫組化2+、3+陽性表達率占所有乳腺癌檢查的48.2%，雖然HER2與GRB7在腫瘤細胞中的定位存在著一定的差異，但兩者間顯著陽性表達率相近，通過相關性分析發現γ=0.83，提示兩者在免疫組化表達存在這明顯的正相關，GRB7蛋白的表達可能依賴HER2的擴增與表達。有研究表明乳腺癌細胞在表皮生長因子的刺激下，與表皮生長因子受體結合的GRB7絡氨酸被鱗酸化，并成為Ras-GTP酶的結合點，進而激活下游的ERK相關的信號通路，從而刺激腫瘤生長[2]。110例乳腺癌病理FISH檢測結果顯示基因擴增的共計36例，其基因擴增多見于HER2免疫組化2+、3+陽性病例。通過相關性分析發現γ=0.78，證實免疫組化及FISH檢測結果存在強相關性，這與目前大多數學者已發表的研究結果類似，進一步明確HER2蛋白和基因的關系；本次研究通過初步探討HER2與GRB7在乳腺癌中表達的關系，印證了乳腺癌HER2蛋白與基因擴增的一致性，且蛋白的表達依賴HER2的擴增與表達。同時顯示HER2與GRB7在乳腺癌細胞中表達存在強相關性，提示GRB7在乳腺癌浸潤、轉移過程中發揮了重要作用，如抑制腫瘤細胞中GRB7的高表達，或許可以提高HER2抑制劑的抑制效果，GRB7可能會成為1個重要的靶分子，有效抑制腫瘤的轉移、延長患者生命。

但本研究有一定局限性，GRB7的基因擴增未能完成，因有研究表面乳腺癌細胞內的GRB7基因與mRNA轉錄水平及基因的拷貝數密切相關，進而促進癌細胞蛋白表達[8]。這將是我們接下來的研究方向，明確GRB7蛋白的作用，構建出GRB7參與細胞信號完整通路，為腫瘤的靶向治療提供新的方向。