不同基因分型乳腺癌中Caspase-3、XIAP、Smac表達情況及與臨床病理參數的關系

王振威 肖 剛 劉 威 李小江 趙永魁

乳腺癌具有高度異質性特點，不同基因型乳腺癌患者治療反應不盡相同[1]。研究表明[2]，細胞凋亡異常與腫瘤發生發展存在密切關系。天冬氨酸酶3(Caspase-3)[3]、X連鎖凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein,XIAP)[4]、第二個線粒體衍生半胱氨酸蛋白酶激動劑(Second mitochondrial activator of caspase,Smac)[5]是細胞凋亡過程中重要調控因子，三者在乳腺癌組織中表達缺乏細致性研究。本研究旨在探討Caspase-3、XIAP、Smac在不同基因分型乳腺癌中表達情況，及其與乳腺癌臨床病理參數之間的相關性。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

選取2015年2月至2017年2月于我院行手術切除治療的73例乳腺癌患者為研究對象，所有受試者術前均未接受任何放化療及內分泌治療，年齡27～73歲，平均年齡(51.43±6.27)歲，根據國際乳腺癌共識(2013年)[6]進行基因分型，其中Luminal A型30例，Luminal B型12例，HER-2過表達型9例，BLBC型22例，高分化21例，低分化52例，TNM分期Ⅰ期21例，Ⅱ期34例，Ⅲ期18例，有淋巴結轉移者26例，無淋巴結轉移者47例。

同期取20例癌旁正常乳腺組織(距癌灶邊緣4 cm以上)作為對照組，本研究經本院倫理委員會批準，且標本采集符合《世界醫學協會赫爾辛基宣言》。

1.2 主要試劑

免疫組織化學(streptavidin-perosidase,SP)試劑盒、二氨基聯苯胺(diaminobenzidine,DAB)顯色試劑盒，購自于北京中杉金橋技術公司；Caspase-3、XIAP、Smac兔抗人單克隆抗體、PBS緩沖液，購自于上海天呈生物用品超市。

1.3 方法

乳腺組織標本離體后，立即使用液氮速凍，于-80 ℃冰箱保存備用。標本經10%甲醛固定，石蠟包埋，制作4 μm石蠟切片，采用SP方法，DAB顯色，應用SP試劑盒檢測石蠟切片中Caspase-3、XIAP、Smac表達情況，陽性切片作為陽性對照，PBS緩沖液代替一抗作為陰性對照，具體操作嚴格按照使用說明進行。

結果判定：以細胞膜/細胞質/細胞核內染色呈現棕黃色顆粒者為陽性表達。陽性細胞所占比例評分標準：≤5%為0分；6%～25%為1分；26%～50%為2分；51%～75%為3分；>75%為4分。染色強度評分標準：無色為0分；淡黃色為1分；棕黃色為2分；棕褐色為3分。由二位病理醫師雙盲閱片，以細胞染色強度與陽性細胞所占百分比評分乘積進行統計學分析，以<1分為陰性(-)；≥1分為陽性(+)。

1.4 統計學分析

應用統計學軟件SPSS 19.0進行數據處理，兩組計數資料比較采用卡方檢驗，不同基因分型中Caspase-3、XIAP、Smac蛋白表達水平比較采用非參數檢驗中Kruskal-Wallis H秩和檢驗，三者表達與乳腺癌組織病理參數之間關系采用Mann-whitney U秩和檢驗，Caspase-3、XIAP、Smac蛋白表達之間相關性分析采用Spearman相關性分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組Caspase-3、XIAP、Smac蛋白表達水平比較

乳腺癌組織中Caspase-3蛋白陽性信號主要定位于細胞質或者細胞核。Caspase-3蛋白在乳腺癌組織中陽性表達率為39.73%，明顯低于癌旁正常乳腺組織陽性表達率90.00%，差異有統計學意義(P<0.05)。具體結果見表1。

表1 兩組Caspase-3蛋白表達比較/例

乳腺癌組織中XIAP蛋白陽性信號主要定位于細胞質。乳腺癌組織中XIAP蛋白陽性表達率為86.30%，明顯高于癌旁正常乳腺組織XIAP蛋白陽性表達率(40.00%)(P<0.05)，見表2。

表2 兩組XIAP蛋白表達比較/例

乳腺癌組織中Smac蛋白陽性信號主要定位于細胞質及細胞膜。乳腺癌組織中Smac蛋白陽性表達率為31.51%，明顯低于癌旁正常乳腺組織Caspase-3蛋白陽性表達率95.00%(P<0.05)。見表3。

表3 兩組Smac蛋白表達比較/例

2.2 不同基因分型乳腺癌組織中Caspase-3、XIAP、Smac蛋白表達水平比較

Caspase-3、XIAP、Smac蛋白表達在Luminal A型、HER-2過表達型、BLBC型之間兩兩比較，差異有統計學意義(P<0.05)。具體結果見表4。

表4 不同基因分型乳腺癌組織中Caspase-3、XIAP、Smac蛋白表達水平比較結果(例，%)

2.3 Caspase-3、XIAP、Smac表達與乳腺癌臨床病理參數的關系

Caspase-3、XIAP、Smac蛋白表達與乳腺癌患者年齡、腫瘤大小、絕經情況無關(P>0.05)，與TNM分期、分化程度、淋巴結轉移有關(P<0.05)。具體結果見表5。

表5 Caspase-3、XIAP、Smac表達與乳腺癌臨床病理參數的關系(例，%)

2.4 乳腺癌組織中Caspase-3、XIAP、Smac表達相關性分析

Spearman相關性分析結果顯示，乳腺癌組織中Caspase-3與XIAP蛋白表達呈明顯負相關(γ=-0.796,P<0.01)，與Smac蛋白表達呈明顯正相關(γ=0.803,P<0.01)，XIAP與Smac蛋白表達呈明顯負相關(γ=-0.712,P<0.01)。

3 討論

乳腺癌是臨床上女性最為常見的惡性腫瘤，全球范圍內發病率呈明顯上升趨勢，給女性身體健康及生命安全造成了巨大威脅[7]。研究表明[8]，不同基因分型乳腺癌疾病進程、流行病學危險因素、治療反應等不盡相同。目前臨床根據PR、ER、HER-2、TNM分期、組織分級、淋巴結轉移等腫瘤指標指導患者治療，但尋找更為精確的新型分子標志物，為乳腺癌患者設計新型治療方式，提高患者臨床療效，仍然是目前乳腺癌臨床研究的重大難點及熱點。

Caspase-3是1種重要半胱氨酸蛋白酶，處于機體細胞凋亡核心位置，其高表達水平可導致細胞凋亡，是機體中重要的死亡蛋白[9]。細胞凋亡途徑中，各種起始因子最終在Caspase-3會合，引發細胞結構水解，導致細胞凋亡發生，Caspase-3作為細胞凋亡級聯反應的必經之路，是細胞凋亡的1個關鍵調控點。研究表明[10]，Caspase-3在肝癌、結直腸癌、胰腺癌等多種惡性腫瘤中異常低表達，說明其活性抑制導致機體細胞凋亡發生障礙，細胞增殖與凋亡動態平衡失調，誘發腫瘤發生及發展。楊勝利等[11]研究結果顯示，Caspase-3蛋白在原發性浸潤性乳腺癌組織中呈異常低表達，Caspase-3參與原發性浸潤性乳腺癌發生及發展過程，且與患者預后密切相關。本研究結果顯示，乳腺癌組織中Caspase-3蛋白陽性表達率為39.73%，明顯低于癌旁正常乳腺組織Caspase-3蛋白陽性表達率90.00%，與上述研究結果相一致。隨后本研究對不同基因型中Caspase-3蛋白表達進行統計研究，結果顯示，Caspase-3蛋白表達在Luminal A型、HER-2過表達型、BLBC型之間兩兩比較差異顯著，提示Caspase-3蛋白表達與乳腺癌基因分型有關，肖剛等[12]研究支持本研究結果。

XIAP作為1種凋亡抑制蛋白，在機體多種正常組織中均有表達，且在肝癌[13]、乳腺癌等[14]多種惡性腫瘤中顯著高表達。本研究結果顯示，乳腺癌組織中XIAP蛋白陽性表達率為86.30%，明顯高于癌旁正常乳腺組織XIAP蛋白陽性表達率40.00%，提示XIAP在乳腺癌組織中呈明顯高表達，參與乳腺癌發生發展，與閆紅等研究結果一致。XIAP在HER-2過表達型、BLBC型乳腺癌組織中陽性表達率高達100%，提示XIAP表達與乳腺癌基因分型密切相關，主要分布在HER-2過表達型、BLBC型乳腺癌組織中。Moraes等[15]研究結果顯示，XIAP在乳腺癌中明顯高表達，且與乳腺癌患者預后及耐藥性有關。本研究結果顯示，XIAP與乳腺癌患者年齡、腫瘤大小、絕經情況無關，與TNM分期、分化程度、淋巴結轉移密切相關，與上述觀點一致。Smac蛋白是Caspase家族線粒體激活因子，作為一種促凋亡蛋白在細胞凋亡過程中發揮重要作用[16]。XIAP與Smac之間存在相互關系，是細胞凋亡過程中重要調控點之一，正常狀態下二者處于動態平衡狀態，一旦平衡打破，則誘導細胞凋亡或者凋亡抵抗發生。本研究結果顯示，乳腺癌組織中Smac蛋白陽性表達率為31.51%，明顯低于癌旁正常乳腺組織蛋白陽性表達率95.00%，且Smac蛋白表達與乳腺癌基因分型存在密切關系，推測XIAP高表達及Smac低表達，從而抑制Caspase表達抑制腫瘤細胞凋亡，導致腫瘤惡性程度增高，發生轉移及復發。Caspase-3、XIAP、Smac蛋白表達與乳腺癌發生發展密切相關，推測三者有望成為早期診斷、評估乳腺癌惡性程度及預測預后的參考指標，具有較高臨床價值。

綜上所述，本研究結果顯示，Caspase-3、Smac蛋白在乳腺癌組織中明顯低表達，XIAP蛋白呈明顯高表達，三者與乳腺癌基因分型、發生發展密切相關。本研究仍存在樣本量較少，僅從組織學水平檢測三者水平等不足之處，乳腺癌中Caspase-3、XIAP、Smac表達所涉及的具體信號通路，后續實驗將進一步充分闡明。