蛋白質組學技術下人皮膚鱗狀細胞癌細胞和基底細胞癌細胞中差異蛋白質分析

王成良

皮膚鱗狀細胞癌還稱為表皮樣癌或者棘細胞癌，來自于附屬器的角朊或表皮細胞的惡性皮膚腫瘤，癌細胞會出現不同程度角化情況。鱗狀的細胞癌一般發生在足、手背部，頭皮和頸部、面部等容易曝光的位置[1-2]。發病的因素和遺傳、紫外線照射、種族、熱輻射或者放射線損壞、瘢痕的增殖、化學的致癌物等有關聯。鱗狀的細胞癌到后期還容易轉移，體內主要器官的轉移、局部的淋巴轉移、全身骨骼的轉移和遠位轉移，有的甚至會威脅到生命安全。皮膚基底的細胞癌為來自于皮膚附屬器或者表皮內多潛能基底樣的細胞分化中較好的惡性皮膚腫瘤，一般多發于鼻溝旁、面部和頰部等位置[3]。發病因素和紫外線照射與日曬有很大關系，與增生性瘢痕、大劑量X射線照射和燒傷等也有一定的聯系。皮膚基底細胞癌一般生長比較緩慢，主要表征是局部皮膚發生損壞，轉移情況極少。

1 材料與方法

1.1 材料來源

皮膚鱗狀細胞癌細胞系A-431(購自美國菌種保藏中心)，皮膚基底細胞癌細胞系TE354.T(購自美國菌種保藏中心)。

1.2 主要設備與試劑

主要試劑：胎牛血清白蛋白(由美國Sigma公司生產)，DMEM高糖培養基(由美國gibco公司生產)，雙抗(由北京Solarbio公司生產)，胎牛血清(由美國Sigma公司生產)，二硫蘇糖醇(由北京Solarbio公司生產)，胰蛋白酶(由北京Solarbio公司生產)，IPG預制干膠條(由美國GE公司生產)，碘乙酰胺(由美國GE公司生產)，丙烯酰胺(由美國Sigma公司生產)。

主要設備：細胞培養瓶(由美國corning公司生產)，TGL-16G臺式高速離心機(由美國Backman coulter公司生產)，VL-4S型超凈工作臺(由珠海再鑫儀器公司生產)，DTX880自動酶標儀(由美國Backman coulter公司生產)，DYCZ-24D雙垂直電泳槽(由美國GE公司生產)，Imagescanner掃描儀(由美國GE公司生產)，SE 600 Ruby蛋白雙向電泳槽(由美國GE公司生產)。

1.3 實驗方法

1.3.1 培養細胞[4]基底的細胞系(TE354.T)與鱗狀細胞系(A-431)都使用細胞培養液(2%雙抗，87%DMEM高糖培養基，11%胎牛血清)，在6% CO2溫度為38 ℃培養箱中培養，依據細胞生長速度制作生長曲線。

1.3.2 提取樣品蛋白[5]2種細胞選取對數生長期，等到細胞生長到培養瓶面面積91%時候，提取樣品蛋白。使用Bradford方法檢測樣品蛋白蛋白質濃度。

1.3.3 IPG預制干膠條重水化[6]雙向凝膠電泳的操作步驟依據實驗儀器說明書來進行：將A-431和TE354.T細胞提取蛋白質溶液和預先配置水化上樣緩沖液從冰箱中取出，室溫靜置融化；將含有100 g蛋白細胞提取蛋白質容易加入到含有水化上樣緩沖液EP管中搖勻；把固相化pH梯度(immobilized pH gradients，IPG)預制干膠條(pH3至11，11 cm)從冰箱中取出，室溫靜置15 min；將水化緩沖液均勻平鋪在槽內，IPG預制干膠條面向下，緩慢放置在盤槽中；1 h后將2 ml礦物油加入水槽中，使IPG預制干膠條完全覆蓋。

進行等電聚焦電泳，并制作11%聚丙烯酰胺凝膠，而后平衡IPG膠條，隨后進行第二向垂直板SDS-PAGE電泳，使用考馬斯亮蘭染色法[7]對交替進行染色。

1.4 凝膠圖像掃面并分析圖像

使用UMAX PowerLook 1100掃描儀對聚丙烯酰胺凝膠掃面，使用Image Master 2D Platinum 10.0圖像分析系統[8]對圖像分析，包含等電點校正、蛋白質點位置、蛋白質點分子量、蛋白質點數量和蛋白質點編輯及匹配等。最后得到這兩種細胞系中蛋白質對應雙向凝膠電泳的圖譜，對圖譜比較分析，把蛋白質點的差異找出，得出差異的蛋白質點對應等電點和分子量等相關數據。

2 結果

2.1 蛋白濃度的檢測情況

595 nm的波長內牛血清蛋白的吸光度測量情況，見表1。

表1 A595與牛血清的蛋白曲線

依據表1的曲線數據，制作標準的曲線，曲線的方程是：Y=1041.753X+0.603。鱗狀細胞系(A-431)的蛋白液在595 nm波長內吸光度為1.104，帶入方程計算得出蛋白質的濃度是1150.7 μg/ml；基底細胞系(TE.354.T)在595 nm波長內吸光度為0.898，帶入方程計算得出蛋白質的濃度是936.1 μg/ml。見圖1。

圖1 牛血清蛋白的標準曲線

2.2 2種細胞系雙向的電泳情況

這兩個細胞系雙向電泳圖譜中的大眼管一樣，分子量一般在16 kDa至149 kDa內，蛋白質的著色點集合于等電點pH 3～8內。

鱗狀的細胞系(A-431)中共有(112±11)個蛋白質點，對應等電點分布范圍是pH 3～7，分子量分布范圍是12～21 kDa和26～163 kDa內?；准毎?TE354.T)中共有(94±8)個蛋白質點，對應等電點分布范圍是pH 3～7，分子量分布范圍是14～139 kDa。

對2種細胞系蛋白雙向凝膠電泳的圖譜對比分析，在2組凝膠內共有19個蛋白質的斑點表達，差異顯著，具有統計學意義(P<0.05)，其中在鱗狀的癌細胞內表達下降的有2個蛋白，在鱗狀的癌細胞內表達上升的有13個蛋白，基底的癌細胞內沒有檢測出的有4個蛋白。

3 討論

基底細胞癌與鱗狀細胞癌都是臨床上較為常見的惡性皮膚腫瘤，且發病于皮膚的附屬器或者表皮，病情發生和進展都與瘢痕增生、紫外線的照射和化學的致癌物等有關聯，同時2種疾病臨床局部表征也有類似的地方[9]，但這兩種疾病在轉移上卻存在很大的差異。由于體內細胞原來存活和生長環境發生了改變引起了腫瘤發生，并受遺傳、物理、生物和化學等原因影響，一些基因表達出現了變化，異常的分化發生在正常組織或細胞內，接著異常的組織過度的出現導致異常的增殖[10-13]。調控因素對體內的基因產生影響后，腫瘤產生的大部分過程中都有蛋白質的參與，而且蛋白質對腫瘤的凋亡、增殖、轉移和侵襲都起著非常重要的作用。通過對蛋白質進行研究，那么對腫瘤前期的診療、降低治療的毒副作用和特異性治療等方面產生積極作用。但在腫瘤的發生和進展中有許多不同的蛋白質參與進來，腫瘤不同的時期，產生作用的蛋白質種類也不盡相同，且不同的蛋白質間也會產生相互影響。

目前對于基底的細胞癌與鱗狀的細胞癌發病、進展、轉移和對血管形成等多種蛋白質調查都有了深入研究，且對于人們感興趣蛋白質在這兩種腫瘤內還進行了差異對比，對正常的皮膚組織、脂溢性的角化病和增生性的瘢痕等有了對比[14-15]。但在細胞內每種蛋白質表達的情況和蛋白質之間的互相影響方面缺少相關的調查。本文研究發現，有19個有差異的蛋白質點存在于這兩種細胞的蛋白質內。蛋白質是遺傳編碼執行者，人類生命發生和進展都取決于組織或者細胞內蛋白質數量與種類。在前期發生腫瘤或出現一些向腫瘤進行分化異性細胞的時候，蛋白質在細胞內的表達就有了改變，接下來在腫瘤不斷進展中，腫瘤發生的轉移、侵襲和浸潤等都是蛋白質表達發生了改變所引起的?；椎募毎┡c鱗狀的細胞癌在腫瘤的轉移方面有很大的差異，那么蛋白質在這兩種細胞內的表達也會出現不同。本文把這兩種癌癥細胞內蛋白質通過雙線凝膠電泳進行分離以后，得到的圖譜中有差異的蛋白質點就是腫瘤內表達不同的蛋白質。

綜上所述，基底細胞系與鱗狀細胞系內提取的蛋白樣品進行的雙向電泳圖譜內有差異存在，這些差異的蛋白質是影響這兩種腫瘤在轉移方面存在差異的主要因素。