酶解改性對燕麥粉中淀粉含量及消化性的影響

王海林,施源德,謝婉研,陳 盛,項雷文

(福建師范大學(xué)福清分校,福建福清 350300)

與其它谷物相比,燕麥具有較均衡的營養(yǎng)成分,可作為蛋白、膳食纖維、淀粉等的良好來源[1]。其中,燕麥淀粉含量在50%～65%之間,包括直鏈淀粉和支鏈淀粉兩部分[2]。直鏈淀粉因分子內(nèi)氫鍵的相互作用,而使分子鏈卷曲成螺旋形,無法溶于水,且在貨架期內(nèi)燕麥淀粉老化返生;支鏈淀粉擁有高度分支結(jié)構(gòu),能溶于水,不易老化返生,但當(dāng)支鏈淀粉老化返生后,也具有不溶性[3]。通過酶解改性可以防止淀粉的老化返生,周素梅等[4]采用α-淀粉酶對燕麥中淀粉進(jìn)行酶解后,制備所得的燕麥乳飲料,無需添加穩(wěn)定劑,就能達(dá)到相對穩(wěn)定效果。Englyst等[5]根據(jù)淀粉的消化速率又將淀粉分成快速消化淀粉(Rapidly digestible starch,RDS)、慢速消化淀粉(Slowly digestible starch,SDS)及抗性淀粉(Resistant starch,RS)。RDS在體內(nèi)消化后會使血糖水平快速提升,SDS則能預(yù)防糖尿病等疾病[6];RS能夠降低血糖水平,還可作為腸道內(nèi)益生菌的生長底物,促進(jìn)益生菌菌群生長[7]。

在前人對燕麥改性(如焙烤、酶解等)的研究中,主要集中在改性條件的優(yōu)化及改性后的應(yīng)用方面,較少對改性前后淀粉的顆粒形貌、含量、及消化性的直接變化及其產(chǎn)生變化的機(jī)理進(jìn)行探討。燕麥淀粉的顆粒形貌會影響其加工后的口感,且其直鏈淀粉和支鏈淀粉,以及快速消化淀粉、慢速消化淀粉及抗性淀粉之間比例亦會影響到燕麥粉的加工性能及其營養(yǎng)價值。

因此，本實驗采用雙波長法對天然燕麥粉、焙烤燕麥粉及酶解燕麥粉中直鏈淀粉、支鏈淀粉及總淀粉含量進(jìn)行測定,并測定其快速消化淀粉、慢速消化淀粉和抗性淀粉含量以評價其消化性,同時采用紅外光譜儀和電鏡對其結(jié)構(gòu)和顆粒形貌進(jìn)行分析,并對其產(chǎn)生變化的機(jī)理進(jìn)行初步探討,以期為燕麥粉的加工改性及應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

燕麥粒、酶解燕麥粉(DE值為40) 廈門格蘭貝爾生物科技有限公司;直鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)品(A0512)、支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)品(A8515)、豬胰α-淀粉酶(50 U/mg)、淀粉葡萄糖苷酶(120 U/mg) 美國Sigma-Aldrich公司;其它試劑 均為分析級,國藥集團(tuán);直鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)溶液(用直鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)品配制濃度分別為5、10、15、20、25、30 μg/mL的溶液);支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)溶液(用支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)品配制成濃度分別為20、40、60、80、100、120 μg/mL的溶液)。

FW100高速萬能粉碎機(jī) 天津市泰斯特儀器有限公司;BS224S電子分析天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司;PHS-3C型數(shù)顯酸度計 上海虹益儀器儀表有限公司;UV754N紫外可見分光光度計 上海佑科儀器儀表有限公司;DHG-9070A電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海精密科學(xué)儀器有限公司;H1850R高速冷凍離心機(jī) 廈門精藝興業(yè)科技公司;Nicolet 380傅立葉變換紅外光譜儀 Thermo Fisher Scientific 公司;SU8010電子顯微鏡 HITACHI公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 燕麥粉的制備 將燕麥粒置于萬能粉碎機(jī)中，粉碎后過60目篩得到天然燕麥粉;將燕麥粒在150 ℃條件下烘烤10 min后,取出冷卻翻面,以免烤焦,重復(fù)四次,再置于萬能粉碎機(jī)中粉碎后過60目篩,得到焙烤燕麥粉,用自封袋封裝后置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?酶解燕麥粉 由廈門格蘭貝爾生物科技有限公司提供。

1.2.2 電鏡掃描 分別取少量天然燕麥粉、焙烤燕麥粉和酶解燕麥粉樣品于雙面膠上,鍍金后,進(jìn)行電鏡掃描,并拍照。加速電壓為10.0 kV。

1.2.3 直鏈淀粉、支鏈淀粉及總淀粉含量的測定 直鏈淀粉、支鏈淀粉含量測定參考蔣卉[8]和劉軼[9]文獻(xiàn)中的方法,略作修改。

1.2.3.1 直鏈淀粉、直鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 取30 μg/mL直鏈淀粉和120 μg/mL支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)溶液，在波長范圍(400～960) nm進(jìn)行掃描(蒸餾水為空白),確定直鏈淀粉的測定波長和參比波長分別為λ1和λ2,支鏈淀粉的測定波長和參比波長分別為λ3和λ4。測定直鏈淀粉和支鏈淀粉的標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度值,以濃度為橫坐標(biāo),吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3.2 三種燕麥粉中水分含量及脂肪含量的測定 采用GB 5009.3-2016[10]中的直接干燥法測定天然燕麥粉、焙烤燕麥粉及酶解燕麥粉三種燕麥粉的水分含量,并采用GB 5009.6-2016[11]中的索氏提取法測定這三種燕麥粉的脂肪含量。

1.2.3.3 三種燕麥粉中直鏈淀粉、支鏈淀粉及總淀粉含量的測定 將1.2.3.2中索氏提取法測定脂肪含量后得到的三種脫脂燕麥粉樣品烘干至恒重,并分別準(zhǔn)確稱取0.2 g三種脫脂樣品于燒杯中,加1 mol/L KOH 10 mL,在80 ℃水浴中溶解,加蒸餾水定容至100 mL,靜置25 min。吸取樣液5 mL于小燒杯中,分別加入50 mL蒸餾水,并用0.1 mol/L 鹽酸調(diào)pH至3.5,加入1 mL碘試劑后,定容至100 mL,靜置25 min。以蒸餾水為空白,在λ1、λ2、λ3、λ4處測定吸光度,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求出稀釋樣品液中的直鏈淀粉和支鏈淀粉的含量。再按公式(1)、(2)、(3)計算出直鏈淀粉、支鏈淀粉及總淀粉含量:

直鏈淀粉(%)=X1×(1-W1-W2)/(5×m)

式 (1)

支鏈淀粉(%)=X2×(1-W1-W2)/(5×m)

式(2)

總淀粉(%)=直鏈淀粉+支鏈淀粉

式(3)

式中:X1、X2分別表示稀釋樣品液中直鏈淀粉和支鏈淀粉含量,μg/mL;W1、W2分別表示樣品中水分含量和脂肪含量,%;5表示吸取樣液的體積,mL;m表示稱取的干燥至恒重的脫脂樣品,g。

1.2.4 快速消化淀粉、慢速消化淀粉及抗性淀粉含量的測定

1.2.4.1 三種燕麥粉中淀粉的提取 燕麥粉中淀粉的提取參考Mirmoghtadaie[12]的研究,分別將三種燕麥粉與0.02 mol/L NaOH溶液按1∶5的比例混合后,于25 ℃條件下攪拌30 min,1400 r/min離心20 min,取沉淀,用50 mL蒸餾水溶解沉淀后,再用300目篩網(wǎng)進(jìn)行過濾,所得濾液用1 mol/L HCl中和后,1400 r/min離心20 min,再用適量的蒸餾水將沉淀重復(fù)洗三次,最后小心取出底部粗淀粉,40 ℃條件下在干燥箱烘干過夜,于干燥器中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4.2 酶液的制備 混合酶液的制備參考Wang等[13]的研究,制備好混合酶液于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4.3 快速消化淀粉、慢速消化淀粉及抗性淀粉含量的測定 淀粉樣品的消化性參考Englyst[14]和胡丹等[15]的研究。準(zhǔn)確稱取1.2.4.1中提取的三種燕麥粉的淀粉樣品100 mg與10 mL乙酸鈉緩沖液于具塞錐形瓶混合后,再加入10 mL蒸餾水,5顆玻璃珠,37 ℃條件下恒溫保持10 min,再加入1 mL上述的混合酶液,37 ℃ 220 r/min條件下進(jìn)行振蕩,分別在20、120 min時取出一個樣品,沸水浴滅酶10 min,冷卻后定容至100 mL,最后用DNS法測定還原糖含量,分別記為G20和G120,再按公式(4)、(5)、(6)計算RDS、SDS及RS含量:

RDS(%)=G20×0.9×TS×100÷M

式(4)

SDS(%)=(G120-G20)×0.9×TS×100÷M

式(5)

RS(%)=TS-(RDS+SDS)

式(6)

式中:G20、G120分別表示酶解20、120 min后釋放的葡萄糖含質(zhì)量,mg;M表示稱取的淀粉樣品的質(zhì)量,mg;0.9表示糖轉(zhuǎn)化系數(shù);TS表示燕麥粉中總淀粉含量,%;100表示百分?jǐn)?shù)的轉(zhuǎn)化。

1.2.5 紅外光譜分析 分別取適量提取出的三種淀粉樣品與溴化鉀研磨均勻,進(jìn)行壓片后,在(4000～400) cm-1波數(shù)范圍內(nèi)用紅外光譜儀進(jìn)行掃描獲得紅外光譜。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

實驗重復(fù)三次,對實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行顯著性(p<0.05)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 顆粒形貌觀察

三種燕麥粉樣品用電鏡掃描,其結(jié)果如圖1所示。

圖1 三種燕麥粉電鏡掃描圖片F(xiàn)ig.1 SEM photos of three oat flour

由圖1可知,三種燕麥粉中的淀粉顆粒大小不一,呈圓形或不規(guī)則形狀。淀粉顆粒之間粘結(jié)在一起,這可能是由于直接用燕麥粉來做電鏡掃描,燕麥粉中含有水分、蛋白質(zhì)等其它成分引起。Ovando-Martinez等[1]在研究熱處理對燕麥淀粉理化性質(zhì)及消化性的影響時,也直接采用了燕麥粉對淀粉顆粒進(jìn)行電鏡觀察。三種燕麥粉中較大的淀粉顆粒中都存在一些裂痕和凹陷,這與Hoover等[16]對燕麥淀粉的研究得出的結(jié)論類似。與天然燕麥淀粉中大淀粉顆粒相比,經(jīng)過熱處理的焙烤燕麥粉和酶解燕麥粉中大淀粉顆粒表面有更多的凹陷,這是由于在熱處理時,淀粉的糊化會破壞其形態(tài)特性,Ovando-Martinez等[1]的研究也表明,熱處理過程會影響其形態(tài)特性。

與天然燕麥粉和焙烤燕麥粉中的淀粉顆粒相比,酶解燕麥粉中的小淀粉顆粒數(shù)量較少,這可能是小顆粒淀粉具有較大比表面積,能夠增大酶與底物的接觸面積,從而更容易被α-淀粉酶分解。Svihus等[17]的綜述中也提到，小顆粒淀粉具有更好的酶解性這一點。另外,酶解后的燕麥粉中大的淀粉顆粒不僅有顆粒被損壞現(xiàn)象,表面出現(xiàn)的凹陷程度也不同,這可能是酶解過程酶會對淀粉顆粒產(chǎn)生腐蝕造成的。

2.2 直鏈淀粉、支鏈淀粉的標(biāo)準(zhǔn)曲線

以蒸餾水為空白,用分光光度計對30 μg/mL的直鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)溶液和120 μg/mL的支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)溶液在400～960 nm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描,結(jié)果如圖2。根據(jù)雙波長法的測定原理,確定直鏈淀粉的測定波長及參比波長分別為λ1=594 nm和λ2=457 nm,支鏈淀粉的測定波長和參比波長分別為λ3=545 nm和λ4=757 nm。

圖2 直鏈淀粉和支鏈淀粉掃描圖譜Fig.2 The scanning map of amylase and amylopectin

用直鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)溶液在594、457 nm處測定吸光度,以直鏈淀粉濃度為橫坐標(biāo),以ΔA=Aλ1-Aλ2為縱坐標(biāo)確定直鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)曲線,如圖3所示。其標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y=0.0175X-0.0489,相關(guān)系數(shù)r=0.9998。

圖3 直鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Standard curve of amylase

用支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)溶液在545、757 nm處測定吸光度,以支鏈淀粉濃度為橫坐標(biāo),以ΔA=Aλ3-Aλ4為縱坐標(biāo)確定支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)曲線,如圖4所示。其標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y=0.0034X+0.0016,相關(guān)系數(shù)r=0.9997。

圖4 支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 Standard curve of amylopectin

2.3 直鏈淀粉、支鏈淀粉及總淀粉的含量

用分光光度計在757、594、545及457 nm四個波長處測定三個樣品的吸光度,再根據(jù)公式計算出三種燕麥粉中直鏈淀粉、支鏈淀粉及總淀粉含量,結(jié)果見表1。

表1 燕麥粉樣品中直鏈淀粉、支鏈淀粉及總淀粉含量Table 1 The content of amylose,amylopectin and total starch in the different oat flour

由表1可知,天然燕麥粉中直鏈淀粉、支鏈淀粉及總淀粉含量分別為16.66%±0.53%、38.30%±0.98%、54.95%±1.51%。與天然燕麥粉相比,焙烤燕麥粉中直鏈淀粉、支鏈淀粉及總淀粉含量均沒有顯著差異(p>0.05),分別為16.47%±0.59%、36.95%±0.59%、53.42%±1.18%。而酶解改性燕麥粉,其直鏈淀粉、支鏈淀粉及總淀粉含量均極顯著降低(p<0.01),分別下降了77.97%、43.55%、46.19%。

酶解過程中,α-淀粉酶能夠作用于淀粉的α-1,4糖苷鍵,將淀粉分解成小分子糖,從而降低直鏈淀粉、支鏈淀粉及總淀粉含量,這有利于防止淀粉老化返生。汪麗萍等[18]研究也表明,α-淀粉酶能夠無差別的作用于燕麥漿中的直鏈淀粉和支鏈淀粉的α-1,4糖苷鍵,將其分解成小分子糊精或糖,且分解產(chǎn)物中含有較多麥芽低聚糖,在液態(tài)食品中可利用其粘度而起到增稠穩(wěn)定作用。采用α-淀粉酶對淀粉進(jìn)行適當(dāng)?shù)乃饽芙鉀Q淀粉老化返生,提高液態(tài)食品穩(wěn)定性,并改善其品質(zhì)[19-20]。

燕麥粉中淀粉、蛋白和葡聚糖纏繞在一起。α-淀粉酶作用后,淀粉粒中淀粉被水解,淀粉粒崩潰,從而使蛋白質(zhì)得到伸展,一些疏水性氨基酸會暴露,從而造成燕麥產(chǎn)品苦澀味。但同時燕麥粉經(jīng)α-淀粉酶水解后,其分解產(chǎn)物中包含的β-環(huán)狀糊精能夠?qū)辔段镔|(zhì)具有包埋作用,從而抑制苦味形成。胡勤玲等[21]研究表明,添加10%β-環(huán)狀糊精于大米蛋白水解液進(jìn)行包埋30 min后,能夠達(dá)到基本脫除苦味的效果。葉發(fā)銀等[22]研究表明,經(jīng)中溫α-淀粉酶改性后的甜菊糖,所制備的產(chǎn)品，其苦味得到明顯的改善,甜度和口感均優(yōu)于原料。

2.4 快速消化淀粉、慢速消化淀粉及抗性淀粉的含量

三種燕麥粉中快速消化淀粉、慢速消化淀粉及抗性淀粉含量見表2。由表2可知,天然燕麥粉中RDS、SDS和RS含量分別為18.75%±1.24%、8.99%±1.68%、27.21%±1.19%。與天然燕麥粉相比,焙烤燕麥粉中RDS、SDS和RS含量沒有顯著差異(p>0.05),分別為18.70%±1.71%、7.73%±0.58%、26.99%±2.28%。而改性燕麥粉中RDS、SDS和RS含量均極顯著降低(p<0.01),分別下降了82.29%、57.06%、33.48%。

表2 燕麥粉樣品中RDS、SDS和RS含量Table 2 The content of RDS,SDS and RS in the different oat flour

淀粉的消化速率是決定人體內(nèi)血糖反應(yīng)重要因素[23]。Araya等[24]研究表明,食用快速消化淀粉含量高的食品,會使血糖水平快速提升,且與糖尿病、冠狀動脈性心臟病等疾病的發(fā)生有關(guān)。酶解改性燕麥粉中RDS含量由原來的18.75%降至3.32%,說明酶解過程極顯著降低了燕麥粉中RDS含量(p<0.01),這有利于維持人體血糖穩(wěn)定。

改性燕麥粉中SDS含量也由原來的8.99%降到3.86%。SDS含量的降低可能與酶解改性過程對淀粉含量及結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的影響有關(guān)。燕麥粉經(jīng)α-淀粉酶作用后,總淀粉含量極顯著降低(p<0.01),且燕麥粉中淀粉鏈結(jié)構(gòu)的平均長度和分支密度也會發(fā)生相應(yīng)的改變。于國萍等[25]在采用酶法改性制備慢消化淀粉的研究中,發(fā)現(xiàn)SDS含量變化與酶解溫度、α-淀粉酶用量、酶解時間及pH有關(guān),在一定范圍內(nèi),SDS含量隨酶解溫度、α-淀粉酶用量、酶解時間及pH的增大而增大,但是當(dāng)超過最適環(huán)境時,SDS含量反而會降低,說明了改性過程酶解條件會影響SDS含量的變化,故在改性時探索最佳酶解條件,有利于燕麥粉的改性加工及應(yīng)用。Ao等[26]和熊姍姍等[27]研究均表明,SDS含量的變化與淀粉鏈結(jié)構(gòu)平均長度和分支密度密切相關(guān),但是過高或過低的分支密度都有可能會使SDS含量降低。

改性燕麥粉RS含量由原來27.21%降到18.10%。RS結(jié)構(gòu)與RDS的結(jié)構(gòu)有著本質(zhì)上的區(qū)別,但是和SDS有類似的結(jié)構(gòu)[28],因此 RS含量的降低可能也和酶解條件及酶解對淀粉含量及鏈長結(jié)構(gòu)與分支密度的影響有一定的關(guān)系。高群玉等[29]在雙酶協(xié)同制備玉米慢消化淀粉及其性質(zhì)研究中表明,隨著β-淀粉酶添加量的增多,所有樣品的RS含量都不斷的降低。另外Serpil等[30]在制備抗性淀粉的研究中也發(fā)現(xiàn),直鏈淀粉含量高及鏈越長的玉米淀粉更有利于形成RS。

2.5 紅外光譜分析

三種燕麥粉淀粉的紅外光譜如圖5所示。由圖5可知,三種燕麥淀粉均分別在3400、2900 cm-1附近出現(xiàn)O-H鍵和C-H鍵的特征吸收峰。在1640 cm-1附近出現(xiàn)由淀粉中水分子的O-H鍵伸縮振動引起的特征吸收峰。在1200～1000 cm-1之間三種燕麥淀粉也均出現(xiàn)由C-O鍵的伸縮振動所引起的三個特征吸收峰,其中1200 cm-1附近的吸收峰則是C-O鍵和C-C鍵的伸縮振動,而1100、1000 cm-1附近出現(xiàn)的吸收峰分別是C-H鍵和C-O-H鍵的彎曲振動[13,31]。因此與天然燕麥淀粉的紅外光譜相比,經(jīng)焙烤和酶解改性后的燕麥粉中淀粉的紅外光譜未出現(xiàn)明顯差異。

圖5 三種燕麥粉淀粉的紅外光譜圖Fig.5 FTIR spectroscopy of three oat starches

傅立葉變換紅外光譜中1047、1022和995 cm-1的吸收強(qiáng)度容易受到淀粉結(jié)構(gòu)變化的影響,其中1047、1022 cm-1吸收強(qiáng)度還分別與淀粉序列和非晶結(jié)構(gòu)有關(guān),1047/1022 cm-1的吸收強(qiáng)度比值可以用來作為淀粉中雙螺旋短序列量的指標(biāo)[32]。此外,與淀粉結(jié)構(gòu)的其它指標(biāo)相比,1047/1022 cm-1和1022/995 cm-1的吸收強(qiáng)度比值是一個更為實用的指標(biāo)[33]。三種燕麥淀粉的特征吸收比值見表3。

表3 三種燕麥淀粉的特征吸收比值Table 3 The characteristic absorbance ratio of three oat starches

由表3可知,與天然燕麥粉淀粉相比,經(jīng)焙烤和酶解改性后的燕麥淀粉在1047/1022 cm-1的吸收比值和1022/995 cm-1的吸收比值沒有顯著差異(p>0.05),這表明焙烤和酶解改性后淀粉的結(jié)構(gòu)沒有發(fā)生顯著變化。

3 結(jié)論

與天然燕麥粉相比,酶解燕麥粉的直鏈淀粉和支鏈淀粉含量均極顯著(p<0.01)降低,這能夠解決傳統(tǒng)燕麥在液態(tài)食品中應(yīng)用時產(chǎn)生的淀粉老化返生等問題;且在酶解過程中,燕麥粉中淀粉、蛋白和葡聚糖聚集體崩潰,從而使β-葡聚糖、蛋白質(zhì)得到伸展,更有利于酶解改性淀粉在溶液中分散。在體外消化模擬中,酶解燕麥粉中RDS、SDS和RS含量均極顯著(p<0.01)低于天然燕麥粉,RDS含量的降低有利于維持血糖穩(wěn)態(tài)。酶解改性后的淀粉中含有的小顆粒較少,且表面凹陷程度不同,將會一定程度上影響燕麥粉加工后的口感。