市售鮮肉中奇異變形桿菌的ERICPCR分型與耐藥性分析

孫冷寧,陳善嬌,王觀杏,畢水蓮,*

(1.廣東藥科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院,廣東廣州 510006;2.廣東藥科大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院,廣東中山 528458)

奇異變形桿菌(Proteusmirabilis)屬腸桿菌科變形桿菌屬,廣泛存在于自然界,人類、家畜、家禽帶菌率極高,是一種條件致病菌[1]。P.mirabilis極易引起肉類污染,且常由于肉類生熟交叉污染引起人體食物中毒[2]。近年來(lái),由P.mirabilis引起的食物中毒事件在全國(guó)頻繁發(fā)生[3]。

ERIC(Entrobacter repetive intergenic consensus)是主要存在于多種細(xì)菌基因組中的串聯(lián)重復(fù)序列,ERIC-PCR技術(shù)是利用ERIC核心的高度保守序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR測(cè)定,其結(jié)果穩(wěn)定、重復(fù)性好、分辨率高[4]、易于實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化,已被廣泛地用于革蘭氏陰性菌和陽(yáng)性菌的分型及同源性檢測(cè)[5],如大腸桿菌[6]、金黃色葡萄球菌[7]、沙門(mén)氏菌[8-9]、銅綠假單胞菌[10]等,但ERIC-PCR技術(shù)用于P.mirabilis尤其是P.mirabils食品分離株的分子分型和溯源的文獻(xiàn)報(bào)道則比較少見(jiàn)[11]。

近年來(lái),由于抗生素的大量及不合理使用,導(dǎo)致P.mirabilis耐藥現(xiàn)象非常嚴(yán)重,已有多篇關(guān)于P.mirabilis耐藥性的研究報(bào)道,但臨床分離株與食品分離株之間、不同地區(qū)之間P.mirabilis的具體耐藥分布差別較大,且鮮少有P.mirabilis食品分離株的基因型與耐藥表型之間關(guān)系的相關(guān)研究報(bào)道。本研究主要針對(duì)中山市市售生鮮肉中分離的P.mirabilis,采用ERIC-PCR法進(jìn)行分子分型,并進(jìn)行藥敏檢測(cè),對(duì)這些P.mirabilis食品分離株的基因型、耐藥表型及其關(guān)系進(jìn)行分析。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

71株P(guān).mirabilis2016年10月從中山市某肉菜市場(chǎng)隨機(jī)采集的豬肉、雞肉和鴨肉中分離得到,由本實(shí)驗(yàn)室-80 ℃凍存;大腸埃希菌ATCC 25922 本實(shí)驗(yàn)室-80 ℃凍存;LB培養(yǎng)基、SS培養(yǎng)基、MH瓊脂培養(yǎng)基 杭州天和生物試劑有限公司;Taq DNA聚合酶、10×Taq Buffer(Mg2+plus)、dNTPs(10 mmol/L each)、6×loading Buffer、DNA ladder Marker、Agarose Regular 寶生物工程(大連)有限公司;GoldView核酸染料 北京賽百盛生物工程公司;四環(huán)素類(四環(huán)素(Tetracycline,TCY)、強(qiáng)力霉素(Doxycycline,DOX))、青霉素類(青霉素(Penicillin,PEN)、阿莫西林(Amoxicillin,AMX)、氨芐西林(Ampicillin,AMP)、萘啶酸(Nalidixic,NAL))、氯霉素類(氯霉素(Chloramphenicol,CHL))、氨基糖苷類(鏈霉素(Straptomycin,STR)、卡那霉素(Kanamycin,KAN)、慶大霉素(Gentamicin,GEN)、壯觀霉素(Spectinomycin,SPT)、丁胺卡那(Amikacin,AMK))、喹諾酮類(諾氟沙星(Norfloxacin,NOR)、環(huán)丙沙星(Ciprofloxacin,CIP))、磺胺類(磺胺甲惡唑(sulfamethoxazole,SMZ)、甲氧芐胺嘧啶(Trimethoprim,TMP))、頭孢菌素類(頭孢曲松(Ceftriaxone,CRO))、大環(huán)內(nèi)酯類(紅霉素(Erythromycin,ERY))9類共18種抗菌藥物紙片 根據(jù)目前國(guó)內(nèi)外P.mirabilis耐藥性的報(bào)道和臨床用藥指南選用,源自英國(guó)Oxoid公司;ERIC-PCR引物(ERIC1:5′-ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC-3′和ERIC2:5′-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3′[12]) 由上海生工生物工程公司合成。

C1000 Touch型梯度基因擴(kuò)增儀、ChemiDOC XRS+超高靈敏度化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)、PowerPac Basic電泳儀 美國(guó)Bio-Rad公司;Micro17R型微量冷凍離心機(jī) 美國(guó)Thermo公司;D1008E型恒溫金屬浴 上海一恒科技有限公司;GHX-9270B-2型隔水式恒溫培養(yǎng)箱 上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;CHA-SA型恒溫振蕩器 江蘇常州朗越公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 模板DNA的提取 復(fù)蘇71株P(guān).mirabilis分離株,分別在SS培養(yǎng)基上劃線,37 ℃培養(yǎng)24 h,挑取單菌落,接種至3 mL LB液體培養(yǎng)基中過(guò)夜增菌培養(yǎng),取1.5 mL增菌液至Eppendorf管中,12000 r/min離心5 min,棄上清液,加入無(wú)菌超純水反復(fù)抽吸洗滌,12000 r/min離心3 min,棄上清液,然后加入200 μL無(wú)菌超純水,充分混勻,100 ℃煮沸20 min后,12000 r/min離心5 min,取上清液置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 ERIC-PCR分型 反應(yīng)體系為20 μL,包含0.1 μL Tag DNA聚合酶(5 U/μL)、2 μL 10×PCR Buffer、0.4 μL dNTPS(10 mmol/L)、1.2 μL ERIC1(10 μmol/L)、1.2 μL ERIC2(10 μmol/L)、2 μL模板DNA和13.1 μL無(wú)菌超純水。反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性5 min后,94 ℃變性30 s,44 ℃退火1 min,72 ℃延伸3 min,循環(huán)35次,最后72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增結(jié)束后,將產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,通過(guò)凝膠成像系統(tǒng)對(duì)電脈條帶進(jìn)行成像。再利用Quantity one軟件對(duì)條帶進(jìn)行處理與分析。

1.2.3 耐藥性檢測(cè) 采用K-B紙片擴(kuò)散法,參照2017年美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)制定的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行試驗(yàn)操作和結(jié)果判讀。實(shí)驗(yàn)過(guò)程大致如下:挑取P.mirabilis單菌落,均勻懸浮于適量生理鹽水中,配制成0.5麥?zhǔn)蠞岫鹊木鷳乙?然后用滅菌棉簽將菌液在M-H瓊脂平板上均勻涂布,待平板稍干燥,用無(wú)菌小鑷子將藥敏紙片緊貼在平板表面,每個(gè)平板貼3～4片,35 ℃倒置培養(yǎng)約18 h后,觀察結(jié)果。試驗(yàn)全程用大腸埃希菌ATCC 25922作為藥敏質(zhì)控菌株,以確保試驗(yàn)的準(zhǔn)確性。根據(jù) NCCLS 標(biāo)準(zhǔn)對(duì)量取的抑菌圈直徑作“敏感”、“耐藥”、“中介”的判斷,而后根據(jù)公式計(jì)算出敏感率、中介率、耐藥率。

敏感率(%)=藥敏結(jié)果為“敏感”的菌株數(shù)×100/總數(shù)

中介率(%)=藥敏結(jié)果為“中介”的菌株數(shù)×100/總數(shù)

耐藥率(%)=藥敏結(jié)果為“耐藥”的菌株數(shù)×100/總數(shù)

1.3 數(shù)據(jù)處理

藥敏實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取其平均值,結(jié)果使用WHONET 5.6軟件(世界衛(wèi)生組織獨(dú)立開(kāi)發(fā))進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理,并通過(guò)Excel進(jìn)行整理分析。使用Quantity One 4.6.2軟件(Bio-Rad公司)構(gòu)建UPGAMA系統(tǒng)發(fā)生樹(shù),實(shí)現(xiàn)對(duì)ERIC-PCR分型圖的聚類分析和相似系數(shù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 ERIC-PCR分型

按照ERIC-PCR的操作步驟,對(duì)71株P(guān).mirabilis進(jìn)行基因分型,應(yīng)用Quantity One軟件對(duì)ERIC-PCR圖譜進(jìn)行同源性分析,結(jié)果見(jiàn)圖1。所有菌株都呈現(xiàn)出良好的多態(tài)性,條帶數(shù)目在3～6之間,片段范圍在100～3000 bp不等,相似系數(shù)為0.64～1.00?；蛐拖嗨菩源笥?0%的菌株通常被視為相同型別,代表同一克隆株,因此,由圖1可知,71株P(guān).mirabilis的ERIC-PCR指紋圖譜共分為50個(gè)基因型,其中P18a、P20a和P19b為同一基因型;C63b、C67b和C65a為同一基因型;C53a和P26a為同一基因型;D16b和C60b為同一基因型;D7b和P16b為同一基因型;C45a和P25a為同一基因型;C47a、C39b和P24a為同一基因型;C61a、P26b、P28a、C68a和P21a為同一基因型;C56b、D5a和C57a為同一基因型;C58a、C26a、D8a、C46a、C59a和P17a為同一基因型。其它40株P(guān).mirabilis分別為不同的基因型。

圖1 71株奇異變形桿菌ERIC-PCR分型系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)和耐藥表型Fig.1 Phylogenetic tree of ERIC-PCR classification and resistance phenotype of 71 strains of P. mirabilis注:a.耐藥類型用數(shù)字加字母表示,其中數(shù)字代表耐藥的數(shù)量,字母代表相同耐藥數(shù)量時(shí)不同耐藥類型。

條帶相似性在75%以上的P.mirabilis菌株可劃分為A～I(xiàn)共9個(gè)簇。C、D、E、F和H簇各包含1個(gè)菌株;A、G簇各包含2個(gè)菌株;B簇包含3個(gè)菌株;I簇是優(yōu)勢(shì)的基因型別,包含59株P(guān).mirabilis,占所有菌株的83.10%。

2.2 藥敏結(jié)果

采用K-B紙片擴(kuò)散法對(duì)71株P(guān).mirabilis進(jìn)行18種抗菌藥物的藥敏檢測(cè),根據(jù)CLSI標(biāo)準(zhǔn)判定實(shí)驗(yàn)結(jié)果,具體見(jiàn)表1。全部P.mirabilis菌株對(duì)STR和ERY均耐藥。65株(91.55%)對(duì)SPT耐藥,62株(87.32%)對(duì)SMZ耐藥,57株(80.28%)對(duì)DOX耐藥,54株(76.06%)對(duì)AMX耐藥,53株(74.65%)對(duì)TMP和CHL耐藥,52株(73.24%)對(duì)GEN耐藥,49株(69.01%)對(duì)TCY耐藥,37株(52.11%)對(duì)AMK耐藥,30株(42.25%)對(duì)AMP、NAL和KAN耐藥,29株(40.85%)對(duì)NOR耐藥,28株(39.44%)對(duì)CIP耐藥。所有抗菌藥物中,CRO和PEN相對(duì)最敏感,敏感率分別為88.73%和83.10%。

表1 71株P(guān). mirabilis藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1 Drug sensitivity results of 71 P. mirabilis strains

2.3 基因型與多重耐藥模式

71株P(guān).mirabilis均至少對(duì)3類及以上抗菌藥物表現(xiàn)為耐藥,因此全部為多重耐藥株。其中,16株耐6～8種藥物,27株耐9～11種藥物,17株耐12～14種藥物,9株耐15～17種藥物,最為嚴(yán)重的是出現(xiàn)了2株全耐菌株(耐18種藥物)。71株P(guān).mirabilis的耐藥分布具體見(jiàn)圖1,可分為60種不同的耐藥類型。

A、B、G簇內(nèi)菌株耐藥類型各不相同,I簇內(nèi)除耐藥類型為8B、9A、9C、12D、15A、18的菌株各有2株外,其它菌株耐藥類型均不同;A、C和H簇分別有1株菌與I簇內(nèi)1株菌具有相同的耐藥表型,B簇有2株菌分別與I簇內(nèi)2株菌具有相同的耐藥表型;菌株C65a和C67b具有相同的基因型(相似性為0.93)與耐藥類型,除此之外,所有基因型相同的菌株耐藥類型均不同,所有耐藥類型相同的菌株基因型也不同。

3 討論

自1989年國(guó)內(nèi)首次從病死肉雞中分離到P.mirabilis,后續(xù)不斷有關(guān)于從禽類中分離到P.mirabilis的報(bào)道[13]。近年來(lái),由P.mirabilis引起的食物中毒的案例呈逐年上升的趨勢(shì)[14],因此選擇合適的分型方法顯得尤其重要。本研究所選用的ERIC-PCR分型方法操作簡(jiǎn)單、快速、成本低,但也存在許多模糊不清的條帶,使用Quantity One軟件自動(dòng)分析會(huì)有對(duì)條帶誤判的情況,需要人工校正,因此存在較大的主觀性。在本次研究中,對(duì)一些模糊不清的條帶人為的判定為無(wú)條帶,所得到的條帶數(shù)目在3～6之間。總的來(lái)說(shuō),71株P(guān).mirabilis的基因型總體相似性較高,可能與所有菌株來(lái)源于同一肉菜市場(chǎng)的樣品,該市場(chǎng)鮮肉檔口少、位置均相鄰,且采樣時(shí)間相對(duì)集中等因素有關(guān),存在P.mirabilis相互污染的潛在可能。

年華等[15]研究表明,P.mirabilis臨床分離株的耐藥情況比較嚴(yán)重,AMP耐藥率最高,其次為復(fù)方新諾明,耐藥率均為80%以上,CIP的耐藥率為69.2%～73.4%,GEN的耐藥率約為60%;CRO的耐藥率約為40%。本研究中P.mirabilis食品分離株的耐藥情況仍然較嚴(yán)重,但耐藥分布有所不同。STR和ERY的耐藥率最高,均為100%,CRO的耐藥率最低,為11.27%,AMP的耐藥率為42.25%,磺胺類的SMZ耐藥率為87.32%,CIP的耐藥率為39.44%,GEN的耐藥率為73.24%。值得注意的是,本研究實(shí)驗(yàn)菌株僅為71株,樣本數(shù)量相對(duì)不多,因此所得結(jié)果不一定能夠準(zhǔn)確反映出P.mirabilis食品分離株對(duì)各藥物的耐藥情況,但P.mirabilis嚴(yán)峻的耐藥趨勢(shì)值得引起高度重視。

自上世紀(jì)80年代起,就不斷有多重耐藥菌的報(bào)道[16],隨著檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展,關(guān)于多重耐藥表型與基因型之間關(guān)系的研究也逐漸增多,但至今未有充分的證據(jù)證明兩者之間存在特定的規(guī)律與聯(lián)系。本研究的結(jié)果也表明,基因型與耐藥表型之間沒(méi)有明顯的相關(guān)性?；蛐?簇)相同的P.mirabilis菌株,其耐藥表型不一定相同;耐藥表型相同的P.mirabilis菌株,其基因型(簇)也不一定相同。究其原因,可能是由于,耐藥基因在不同P.mirabilis菌株或微生物之間的移動(dòng)導(dǎo)致耐藥的種類和菌株數(shù)量不斷增加,使得菌株的基因型和耐藥表型發(fā)生改變。耐藥基因轉(zhuǎn)移的方式可能是由質(zhì)粒介導(dǎo)的超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(Extended-Spectrumβ-Lactamases,ESBLs)通過(guò)接合、轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)等形式獲得或轉(zhuǎn)移耐藥基因,也可能是通過(guò)攜帶耐藥基因的整合子或耐藥基因島的移動(dòng)所引起。

4 結(jié)論

本研究中,中山市市售生鮮肉中分離的71株P(guān).mirabilis菌株的基因型相似性高,相似性系數(shù)為0.64～1.00,以75%為界可分為9個(gè)簇。分離菌株的耐藥情況嚴(yán)重,均為多重耐藥菌,且至少耐6種藥物,測(cè)試的18種抗生素中,對(duì)鏈霉素和紅霉素的耐藥率最高,均為100%;對(duì)青霉素和頭孢曲松耐藥率最低,分別為16.90%、11.27%。其基因型與耐藥表型之間雖然沒(méi)有明顯的相關(guān)性,但是仍可為P.mirabilis引起的食物中毒溯源及藥物治療提供參考。關(guān)于奇異變形桿菌由基因主導(dǎo)的耐藥機(jī)制還需要進(jìn)一步的探討和研究,為更好地防治多重耐藥菌提供依據(jù)。