甜櫻桃采后腐爛病原菌的分離與鑒定

王 楚,張 倩,李 陽,牛 宇,楊 埔,牛 偉,張麗珍,*

(1.山西大學生命科學學院,山西太原 030006;2.山西省農業科學院,農業資源與經濟研究所,山西太原 030006;3.山西省農業科學院,山西太原 030031)

甜櫻桃(PrunusaviumL.)又名大櫻桃、車厘子、西洋櫻桃,為薔薇科(Rosaceae)櫻桃屬(Cerasus)植物,原產歐洲和西亞,19世紀70年代從歐洲傳入中國[1-2]。甜櫻桃是中國增長最快的栽培和消費水果之一[3-5]。山西因地處黃土高原東部,土層深厚、光照充足,氣候獨特、晝夜溫差大,生產的櫻桃甜度大、口感好,正逐漸發展成為甜櫻桃的中晚熟品種的主產地。甜櫻桃果實有非常高的營養價值,生物活性成分也極其豐富,包括維生素C、花青素、槲皮素、黃烷-3-醇、黃烷醇和羥基肉桂酸鹽等[6],具有較強的抗氧化能力,在預防疾病和維持人體健康方面起著非常重要的作用[7-8]。

新鮮的甜櫻桃果實皮薄、柔軟多汁、營養豐富,加上采收時氣溫較高,空氣濕度大,為各類病原微生物的生長提供了有利的溫度和濕度條件[9]。空氣濕度較高容易導致櫻桃發生裂果的現象,形成微創口,更容易感染病原菌,采后不耐貯運,據報道每年因微生物侵染引起甜櫻桃采后損失高達50%以上[10]。目前國內外對甜櫻桃真菌性病害研究尚少,且對病害的防治策略尚不明確。

為明確引起山西地區甜櫻桃采后腐爛的病原菌種類,本研究針對產自山西省櫻桃種植地的甜櫻桃果實在低溫貯藏過程中的病原微生物,對其進行分離純化,在形態學基礎上,結合基因序列進行分析,從分子水平上將菌株鑒定到屬種,以期為甜櫻桃采后貯藏保鮮提供一定的科學依據和理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紅瑪瑙甜櫻桃 山西省農科院櫻桃種植基地;Tris飽和酚、氯仿 生工生物工程(上海)股份有限公司;異丙醇 國藥集團化學試劑有限公司;70%乙醇 天津市化學試劑三廠;Master Mix酶、核酸染色劑 全式金生物技術有限公司;硫酸鎂 天津市恒興化學試劑制造有限公司;蔗糖、硫酸亞鐵 天津市風船化學試劑科技有限公司;硝酸鈉 天津市光復科技發展有限公司;氯化鉀、磷酸氫二鉀 天津市天新精細化工開發中心;瓊脂粉、PDA粉 北京索萊寶科技有限公司;蛋白胨 北京奧博星生物技術有限責任公司;保鮮盒 臺州黃巖捷旺模具有限公司。

BXM-30R不銹鋼立式壓力蒸汽滅菌、BSP-150生化培養箱 上海博迅實業有限公司;FK-A 組織搗碎機 常州國宇儀器制造有限公司;G50研磨儀 佛山市順德區冠宇達有限公司;BCM-1000A超凈工作臺 蘇凈安泰;OLYMPUSDP73正置熒光顯微鏡 東京都涉谷區幡之谷生產;Neofuge13臺式高速離心機、T960 PCR擴增儀 力康生物醫療科技控股集團;DYCP-31DN電泳儀 北京市六一儀器廠;Ge1DocXR+凝膠成像系統 美國Bio-Rad公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 甜櫻桃的預處理 選擇顏色大小一致、無病蟲害、無機械損傷的櫻桃果實在(0±0.5) ℃預冷24 h后,裝入15 cm×10 cm×6 cm的經紫外燈照射過30 min的保鮮盒中封閉保存,每盒300.0 g樣品,共30盒樣品,貯藏于0 ℃冷庫中,貯存30 d左右,取有明顯病癥的果實分離病原菌。

1.2.2 病原菌的分離純化 收集在0 ℃冷庫中的櫻桃病果,用組織分離法進行分離。用75%酒精表面消毒5 s后,用無菌水清洗3次,用滅過菌的鑷子撕去櫻桃表皮,取其中的病果組織接種于PDA培養基平板中,將平板置于28 ℃生化培養箱中培養,待菌落長出后采用平板劃線法分離,后于28 ℃生化培養箱中培養3 d,將獲得的菌落純化多次直至獲得單一菌落。將純化的菌株置于4 ℃冰箱保存備用。

1.2.3 病原菌致病性檢測 根據柯赫氏法則[11-13],將分離純化得到的病原菌回接到健康的櫻桃果實上。選取60顆健康櫻桃果實并將其在2%的次氯酸鈉溶液中浸泡30 s,無菌水漂洗3次,自然風干。用經高壓蒸汽滅菌的針在果實赤道部刺3 mm深的傷口,取10 μL濃度為105CFU·mL-1菌懸液接種于刺傷部位,接種后將其置于密封的塑料盒中,并在28 ℃生化培養箱中培養3～5 d,重復3次。每隔24 h觀察病斑發展速度與發病程度,選取明顯發病果實再次進行病原菌的分離鑒定,判斷與所接菌株的菌落形態是否一致,若一致則為采后病原菌。

1.2.4 病原菌的形態學分析

1.2.4.1 病原菌的菌落形態分析 將分離純化后所得的一定數量病原菌分別接種到PDA培養基中,置于28 ℃生化培養箱培養3～5 d進行形態學觀察。

1.2.4.2 病原菌的顯微形態分析 將滅過菌的蓋玻片以45 ℃角插入察氏培養基內,將菌種用接種環接在蓋玻片與培養基相接的沿線上,將平板置于28 ℃生化培養箱中培養,病原真菌YTA培養5～7 d,病原真菌YTB培養10～14 d。用鑷子將蓋玻片取出,將長勢好的一面蓋在已滴有1滴乳酸酚棉藍染液的載玻片上,擦去蓋玻片上菌種長勢較差的一面,在顯微鏡下對病原菌菌絲體和分生孢子進行形態觀察、拍照[14]。

1.2.5 病原菌分子生物學鑒定 用無菌解剖刀刮取0.1～0.2 g病原真菌YTA和YTB菌絲于1.5 mL離心管中,加入少量的聚乙烯吡咯烷酮(PVP),石英砂和預熱的CTAB抽提液用G50研磨儀研磨至勻漿,采用改良的CTAB法[15]提取病原真菌基因組DNA,置于-20 ℃冰箱保存備用。應用真菌核糖體基因轉錄間隔區通用引物ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGA TATGC-3′)和ITS5(5′-GGAAGTAAAAGTCGTAA CAAGG-3′),以分離得到的病原菌基因組DNA為模板進行PCR擴增;引物均由金唯智(蘇州)有限公司合成。50 μL PCR反應體系:94 ℃變性4 min,94 ℃ 50 s,55 ℃ 1 min,72 ℃ 1 min,共35個循環,72 ℃延伸10 min。擴增產物經0.8%瓊脂糖凝膠電泳,在全能成像系統上觀察并記錄結果。PCR產物送往金唯智(蘇州)有限公司測序。

1.2.6 系統發育樹的構建 將測序所得的基因序列拼接后,提交到NCBI的GenBank數據庫,應用BLAST進行同源序列比對,下載相近的參比序列并利用MEGA6.0軟件以NJ鄰接法構建系統發育樹,分析病原菌與同屬其它菌株的親緣關系,以確定其分類地位。

2 結果與分析

2.1 病害癥狀及致病性

將從甜櫻桃果實發病部位分離出的2株病原菌,編號為YTA和YTB,回接于健康櫻桃的刺傷部位進行致病性實驗。實驗結果表明接種YTA時,接種第4 d時果實出現明顯病癥,發病率為100%;YTB在第4 d時果實出現病癥,發病率為100%;回接后出現的癥狀與自然條件下發病癥狀一致(圖1)。回接YTA后出現綠色病斑,病斑凹陷,呈現水樣狀;回接YTB后出現白色病斑,之后果柄處長出白色菌絲,整個果實呈現黑褐色,后期全果腐爛。從甜櫻桃發病部位重新分離病原菌,得到的病原菌與所接病原菌形態一致。由此證明YTA和YTB病原菌均是造成山西省甜櫻桃采后腐爛的病原菌。

圖1 病原菌回接櫻桃Fig.1 Sweet cherry fruits inoculated with the pathogens注:圖中左側為病果樣品,右側為病原菌回接結果

2.2 病原菌的形態學分析

2.2.1 菌落形態學分析 將2株病原菌分別接種到PDA培養基中,置于28 ℃生化培養箱培養3～5 d進行形態學觀察。YTA菌絲初期為白色,培養3 d左右開始變為灰綠色,菌落相對平坦,質地絨毛狀或絮狀,在菌落邊緣形成一圈濃密白色絨毛,菌落中間呈灰綠色,6～7 d可長滿直徑為9 cm的PDA培養基,菌落在培養皿背面近于黃色,易于觀察(見圖2a);YTB菌落疏松、干燥、不透明、不易挑取、質地呈絨毛狀、菌絲稀疏其形態類似針狀向外輻射,初期為白色后逐漸變為深灰色,產孢量少,培養皿背面呈黑褐色(見圖2b)。

圖2 2株病原菌的菌落形態Fig.2 Colony morphology of the two strains pathogens 注:a:YTA;b:YTB。

2.2.2 顯微形態分析 將2株病原菌在顯微鏡下進行顯微觀察。YTA的分生孢子呈橢圓形,大小均勻(見圖3a);在分生孢子梗端連續成串生長,分生孢子鏈呈圓柱狀,分生孢子梗通常單輪生,偶有雙輪生或三輪生,無隔膜,幼齡時分生孢子梗呈瓶狀(見圖3b);成熟時分生孢子梗呈笤帚狀,分生孢子大量產生易脫落(見圖3c)。YTB的分生孢子呈卵圓形,大小不均一,分生孢子呈灰綠色(見圖3d);頂端形成膨大的頂囊(見圖3e);菌絲體疏松,成網狀,菌絲粗糙有隔膜,分生孢子梗不明顯,分生孢子頂生或側生(見圖3f)。

圖3 2株病原菌的顯微形態(40×)Fig.3 Microscopic morphology of the two strains pathogens(40×)注:a:YTA分生孢子,b:YTA幼齡時分生孢子梗,c:YTA成熟時分生孢子梗;d:YTB分生孢子,e:YTB膨大的頂囊,f:YTB菌絲和分生孢子。

2.3 基因序列分析結果

應用ITS通用引物進行PCR擴增,YTA和YTB菌株分別獲得了長度為500 bp左右的清晰條帶,電泳結果見圖4。將純化的PCR產物直接測序,分別獲得了551和490 bp的序列。

圖4 PCR擴增產物凝膠電泳結果Fig.4 Electrophoresis analysis of PCR amplified products注：M：Marker。

2.4 系統發育分析

對2株病原菌進行分子生物學鑒定,將PCR擴增后的產物進行測序,將測序所得的基因序列提交到NCBI的GenBank,應用BLAST進行同源序列比對。病原真菌YTA的ITS序列與GenBank中Penicilliumoxalicum和Penicilliumsimplicissimum有較高的同源性。從GenBank數據庫中選取代表青霉屬不同種的ITS序列,以爪哇正青霉Eupenicilliumjavanicum(KF313084)作為外群構建系統發育樹,結果顯示:菌株YTA與親緣關系較近的草酸青霉(PenicilliumoxalicumDQ123663)聚于同一支(圖5)。結合形態學特征,最終將病原真菌YTA鑒定為草酸青霉(Penicilliumoxalicum)。

圖5 YTA菌株基于rDNA-ITS序列的系統發育樹Fig.5 Phylogenetic tree based on the rDNA-ITS sequences of YTA pathogen

病原真菌YTB的ITS序列與GenBank中Botrytiscinerea和Botrytisfabiopsis有比較高的同源性。從GenBank數據庫中選取代表葡萄孢屬不同種的ITS序列,以果生鏈核盤菌Moniliniafructicola(EF207421),桃褐腐病菌Monilinialaxa(EF153016)和核盤菌Sclerotiniasclerotiorum(KF878372.1)作為外群構建系統發育樹,結果顯示:菌株YTB與親緣關系較近的葡萄孢屬(Botrytissp.LeekBC-18FJ169673)聚于同一支(圖6)。結合其形態學培養特征,將病原真菌YTB鑒定為葡萄孢屬(Botrytissp.)。

圖6 YTB菌株基于rDNA-ITS序列的系統發育樹Fig.6 Phylogenetic tree based on the rDNA-ITS sequences of YTB pathogen

3 討論與結論

目前已報道引起甜櫻桃果實采后腐爛的病原微生物主要有青霉屬(Penicillium)、鏈核盤菌屬(Monilinia)、鏈格孢屬(Alternaria)、炭疽菌屬(Colletotrichum)、葡萄孢屬(Botrytis)、曲霉屬(Aspergillus)、根霉屬(Rhizopus)、枝孢霉屬(Cladosporium)、鐮刀菌屬(Fusarium)、地絲菌屬(Geotrichum)、盤長孢屬(Gloeosporium)、毛霉屬(Mucor)、成團泛菌(Pantoeaagglomerans)等[16-18]。本研究對山西晉中地區低溫貯藏過程中甜櫻桃的病原菌進行分離純化與回接,獲得了2株真菌YTA和YTB。對2株病原菌YTA和YTB進行分子生物學鑒定,結合其形態學特征,分別鑒定為草酸青霉(Penicilliumoxalicum)、葡萄孢屬(Botrytissp.)。

張先富等[19]將草酸青霉作為一種拮抗菌來抑制連作土壤中尖孢鐮孢菌生長。本實驗中對病原菌YTA進行分離鑒定后進一步進行甜櫻桃果實體外致腐性實驗,接種病原菌YTA的櫻桃果實均發病,且發病癥狀與低溫貯藏過程中癥狀一致,從發病部位重新分離病原菌,得到的病原菌與所接病原菌形態一致,由此證明草酸青霉(Penicilliumoxalicum)是引起山西省甜櫻桃采后腐爛的一種病原真菌。

葡萄孢菌(Botrytiscinerea)是采后甜櫻桃果實灰霉病原菌[20-22]。病原菌進行分離鑒定后進一步進行甜櫻桃果實體外致腐性實驗,結果表明葡萄孢屬(Botrytissp.)同樣是引起山西省甜櫻桃采后腐爛的病原菌。

本次實驗與以往研究的引起甜櫻桃采后腐爛的病原微生物種類有所差異,究其原因可能是不同病原菌侵入不同品種櫻桃組織的途徑不同,以及地理環境、生長條件和氣候條件等方面的差異,而導致在貯藏過程中引起櫻桃腐爛的病原微生物種類存在一定的差異[14]。通過對山西省低溫貯藏過程中甜櫻桃病原菌的研究,明確了引起甜櫻桃采后病原菌的種類,為進一步加強新鮮櫻桃運輸、貯藏過程中微生物病害防治及今后抑制甜櫻桃的腐爛奠定了理論基礎。