食品過敏原牡蠣成分PCR檢測方法的初步研究

張懿翔,曲勤鳳,余順吉,胡雪蓮,熊 薇,葛 宇

(上海市質量監督檢驗技術研究院,上海 200233)

食品過敏原是指能對特定人群產生免疫反應或者過敏反應的蛋白質和其他相關物質。食品過敏屬于機體對外源物質產生的一種變態反應[1]。據統計,全球約有1%的成人和2.5%的兒童患有食物過敏癥,每年因此造成150人以上的死亡以及超過2萬人次的急救處理[2]。在發達國家約有6%的兒童和3%～4%的成年人被這種免疫介導性疾病所困擾[3-4]。食物過敏已被世界衛生組織列為21世紀重點防控疾病之一[5]。目前大約有160多種食品含有可以導致過敏反應的食品過敏原。尤其是對海產品成分過敏現象較為嚴重。近年來對于海產品過敏原的研究也日益增加,黃榕芳等[6]、伍慧妍等[7]、劉志剛等[8]發現海產品中軟體類動物主要的過敏原是蛋白原肌球蛋白,曹際娟等[9]建立了對蝦源性成分的PCR方法,沈海旺等[10]對甲殼類食品過敏原三維結構的研究,獲得4種過敏原分子特征抗原表位及部分三維結構。牡蠣屬于歐盟法規中食品過敏原的種類14個種類中的軟體動物。目前對于甲殼類動物與軟體動物之間具有交叉過敏原[11-13]的情況有一定報道,然而關于牡蠣過敏原的相關報道卻較少。

牡蠣是常見的世界性的貝類,屬于軟體動物。在我國及世界其他國家都是一種營養價值很高的珍貴海產品,目前已發現有100多種,全世界瀕海各國幾乎都有存在[14]。牡蠣不僅是重要的食材,而且具有較高的藥用價值,但同時牡蠣又可引起各種過敏反應癥狀,其食用安全性令人擔憂,隨著牡蠣相關保健品及其他產品的不斷開發,對于牡蠣成分檢測的需求也在提高。目前基于牡蠣線粒體基因分析的一些研究[15-16],雖然能夠檢測出牡蠣樣品,但是其特異性不足,不能區分出相類似的樣品(扇貝、蛤蜊等)。

針對上述問題,本研究旨在建立一種靈敏度高且特異性強的食品過敏原牡蠣成分的檢測方法,以期能夠快速有效的對牡蠣相關產品進行檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

海外牡蠣(澳洲、愛爾蘭、法國、加拿大、丹麥) 上海市出入境檢疫局;國產牡蠣(山東青島、山東乳山、福建、浙江、海南等) 來自實驗室收集樣品;蛤蜊、扇貝、鮑魚、靑魚、蝦、豬肉、牛肉、羊肉、牦牛肉、雞肉、鴨肉、貓肉、大豆、玉米、大米、黃瓜、番茄、狗肉、蝸牛等陰性樣品 為本實驗室收集樣品;海蠣干、海蠔罐頭、耗油、蠔汁等牡蠣類產品 收集于市場或超市;SYBR Green I PCR擴增試劑2×SYBR? Premix Ex TaqTM(2X) ,貨號RR420L 寶生物(大連)有限公司;商業化DNA提取試劑盒High Pure PCR Template Preparation Kit 瑞士Roche公司;十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)提取液(54.9 mmol/L CTAB、1.4 mol/L NaCl、0.1 mol/L Tris-HCl、0.02 mol/L 乙二胺四乙酸(EDTA),pH8.0) 實驗室自制。

Veriti 96 Well Thermal Cycler PCR儀;7500/7500 Fast Real Time PCR System實時熒光PCR儀 美國ABI公司;DYY-6C型電泳儀 北京六一儀器廠;UNIVERSAL HOOD II 凝膠成像儀 美國BIO-RAD公司;微量紫外分析儀DS-11 美國DeNovix公司;冷凍離心機 Centrifuge 5810R 德國Eppendorf公司;FreeZone 4.5 Plus冷凍干燥儀 美國Labconco公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 人工污染模擬樣品 使用冷凍干燥儀將粉碎好的牛肉和牡蠣肉干燥再磨成粉末狀,并于80 ℃烘干6 h。以牛肉為主要基質與其他樣品配成牡蠣含量為10%、1%、0.1%的模擬樣品。

1.2.2 樣品DNA的提取 150 mg左右的樣品中加入1 mL CTAB提取液(20 g/L CTAB,1.4 mol/L NaCl,0.1 mol/L Tris-HCl,0.02 mol/L Na2EDTA,pH8.0)和20 μL蛋白酶K溶液(20 mg/mL),56 ℃振蕩2 h(或者過夜),13000×g離心5 min,轉移上清液800 μL到新的離心管中,加入與上清液等體積的酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1)混合液用力振蕩混合后,13000×g離心10 min,將上清液600 μL轉移到新的離心管中,再次加入與上清液等體積的氯仿/異戊醇(24∶1)溶液,用力振蕩混合后,13000×g離心10 min,將上清液400 μL轉移到新的離心管中,加入2倍體積的預冷的無水乙醇溶液,混合均勻后室溫放置20 min,13000×g(離心2 min,棄去上清液,加入1 mL 70%乙醇溶液洗滌沉淀2次,倒去乙醇溶液,晾干后加入200 μL TE溶液(1 mmol/L Tris-HCl,0.1 mmol/L Na2EDTA,pH8.0)溶解。DNA提取完成后,用微量紫外分析儀測定DNA濃度,所提取的樣品的DNA溶液均稀釋到工作濃度(約100 ng/μL)。對于一些含量較低的樣品與深加工樣品使用High Pure PCR Template Preparation Kit Roche試劑盒進一步純化。

1.2.3 引物設計及篩選 引物設計:線粒體DNA標記,由于其基因分布的普遍性、序列和結構的相對保守性而被廣泛應用于分子系統研究及種的鑒定等方面。利用DNASTAR軟件針對牡蠣DNA中序列高度保守的三段基因序列,牡蠣線粒體DNA基因序列(AF177226.1)、細胞色素c氧化酶亞基1(COI)基因序列(AF300616.1)、牡蠣16Sr RNA基因序列(AY510450)設計10對引物,引物均由上海英濰捷基合成。

引物篩選:通過對牡蠣陽性樣品擴增效果確定各個引物的最佳退火溫度、初步篩選引物;選取擴增特異性最強、擴增效果與熔解曲線最適宜的引物,獲得下列最佳引物。

AD-3(5′-3′):TGGGGCTTAGTTTGATAGTAG GTA,AD-4(5′-3′):TAGCTCCAGGGTTATAAAGTC TCC,365 bp。

1.2.4 PCR擴增條件優化 以牡蠣(樣品)DNA為模板,使用篩選出的最佳引物進行實驗。

普通PCR反應體系和反應條件:DNA模板1 μL,2×Mix 10 μL,上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL,用無菌水補至總體積為20 μL。擴增條件為:94 ℃,3 min;94 ℃,30 s,48 ℃,30 s,72 ℃,30 s,35個循環;72 ℃,7 min。取5 μL PCR產物,加1 μL 6X上樣緩沖液點樣進行電泳。PCR電泳檢測所用的凝膠濃度為2.0%。陰性對照為不含牡蠣成分的樣品,空白對照為無菌水。

SYBR Green I實時熒光PCR反應體系和反應條件:SYBR Premix Ex TaqTM2×10 μL,PCR上游引物(5 μmol/L)0.5 μL,PCR下游引物(5 μmol/L)0.5 μL,DNA模板1 μL,用滅菌蒸餾水補足20 μL的總反應體系。PCR反應程序(參照熒光SYBR Green I PCR擴增試劑的說明進行調整):預變性,95 ℃,30 s,循環數1;PCR反應,第一步,95 ℃變性5 s;第二步,65 ℃退火延伸34 s,同時在退火過程中收集熒光信號,共進行40個循環;熔解曲線分析:95 ℃,15 s;60 ℃,1 min;95 ℃,15 s。退火溫度摸索范圍為61～68 ℃。

1.2.5 PCR產物的測序驗證 對PCR產物進行測序,然后于NCBI數據庫(https://www.ncbi. nlm. nih.gov/)上進行BLAST,與牡蠣相關序列進行對比。

1.2.6 PCR檢測靈敏度實驗 用微量紫外分析儀測定通過提取得到的樣品DNA濃度,用無菌去離子水將DNA溶液稀釋成質量濃度分別為100、50、3.125、0.78、0.2、0.1、0.05、0.025、0.01 ng/μL的溶液,分別取1 μL進行普通PCR擴增以及熒光PCR擴增。反應體系同1.2.4,同時將牡蠣含量為10%、1%、0.1%的人工模擬污染樣品提取DNA用于靈敏度實驗。

1.3 數據處理

普通PCR結果通過電泳圖譜分析,SYBR Green I實時熒光PCR的結果通過ABI 7500自帶的曲線分析功能與Ct值數據確認牡蠣的特異峰與Tm溫度。每個樣品取至少雙平行復孔,重復10次實驗。TM溫度通過各個陽性樣品的平均值得出。

2 結果與分析

2.1 引物篩選PCR檢測

分別對利用十對設計引物進行PCR擴增,根據特異性等條件篩選如圖1。有6對引物能夠成功擴增,于是又對上述引物進行SYBR Green I實時熒光PCR實驗,只有AD-3,AD-4為上下游引物具有明顯的擴增曲線與熔解曲線。

圖1 PCR引物篩選Fig.1 Screening results of PCR primers 注:1～22:分別為設計的引物擴增結果;其中19、20為最終選擇引物AD3、AD4的擴增結果。

最終選擇引物AD-3,AD-4為最佳上下游引物,分別對十種牡蠣陽性樣品進行PCR擴增,結果如圖2所示,可以看出該引物能夠擴增出牡蠣成分,擴增產物大小為365 bp。同時對其他二十余種動植物樣品進行PCR擴增,結果樣品與空白對照均為陰性如圖3。

圖2 陽性樣品PCR結果Fig.2 Samples with positive PCR results注:1～10:牡蠣樣品分別來自澳洲、愛爾蘭、法國、加拿大、丹麥、山東青島、山東乳山、福建、浙江、海南;11:陰性對照;12:空白對照。

圖3 陰性樣品PCR結果Fig.3 Samples with negative PCR results 注:1～3:為陽性對照、陰性對照、空白對照;4～22為牡蠣陰性樣品蛤蜊、扇貝、鮑魚、靑魚、蝦、豬肉、牛肉、羊肉、牦牛肉、雞肉、鴨肉、貓肉、大豆、玉米、大米、黃瓜、番茄、狗肉、蝸牛。

2.2 PCR擴增結果的測序驗證

通過對擴增產物進行測序,將其結果在NCBI上進行BLAST,結果顯示與AF177226.1同源性達到了99%,如圖4,同時與KJ855245.1、EU672831.1等牡蠣線粒體序列的同源性也達到了99%。

圖4 測序產物BLAST結果Fig.4 Results of BLAST sequencing products

2.3 SYBR Green I熒光PCR結果分析

本實驗分別對所收集樣品進行SYBR Green I實時熒光PCR檢測,獲得了S型擴增曲線,得到PCR儀分析出的從基線到指數增長的拐點所對應的循環次數Ct值,結合熔解曲線與其對應的熔解溫度(Tm)分析得到的特征峰(見圖5),平均Tm值通過對各個樣品收集數據計算出為80.08 ℃平均Ct值為19.40(見表1),所有牡蠣樣品的Ct值和Tm值與陽性對照相符,由此通過基于SYBR Green I的熔解曲線分析熒光PCR方法可以快速的檢測牡蠣成分。在實驗過程中初步退火溫度選擇為60 ℃時,陰性樣品中蛤蜊樣品與扇貝樣品出現了非特異性擴增。在進一步的實驗中,分別選擇61～68 ℃作為退火溫度進行實驗,當退火溫度為63 ℃時,蛤蜊的Ct值在35左右,扇貝的Ct值在38左右,從熔解曲線分析可知牡蠣樣品的特征峰值更高,而蛤蜊、扇貝等樣品的特征峰偏低并且Tm值較牡蠣低。隨著退火溫度的升高(61～64 ℃)蛤蜊、扇貝樣品的Ct值、Tm值下降但仍存在一部分非特異性擴增的情況,當退火溫度提升至65 ℃時,基本能消除非特異性擴增,陰性樣品均無S型擴增曲線出現,并且無特征峰和相應的Tm值(見圖6),而退火溫度提升至68 ℃時,雖然非特異性擴增被完全消除,但陽性樣品的擴增也會受到一定抑制(見表2)。

圖6 蛤蜊、扇貝、牡蠣陽性樣品的熔解曲線、擴增曲線比較Fig.6 Comparison of dissolution curves and amplification curves for positive samples of clams,scallops and oysters注:a. 60 ℃退火熔解曲線;b. 60 ℃退火擴增曲線;c. 65 ℃退火熔解曲線;d. 65 ℃退火擴增曲線。

表1 牡蠣樣品平均Tm值Table 1 Average Tm of oyster samples

表2 不同退火溫度下樣品Tm值Table 2 Tm of samples at different annealing temperatures

圖5 牡蠣陽性樣品的SYBR Green I熔解曲線Fig.5 Dissolution curves of SYBR Green Ifor positive oyster samples

2.4 牡蠣成分的PCR檢測靈敏度

分別取1 μL濃度為100、50、12.5、3.125、0.78、0.2、0.1、0.05、0.025、0.01 ng/μL的樣品DNA溶液進行普通PCR擴增以及SYBR Green I實時熒光PCR擴增。在檢測中,普通PCR的電泳結果表明,可以明確檢測出濃度為0.05 ng/μL的樣品(見圖7),當樣品DNA濃度的進一步降低的情況下,電泳條帶變得不明顯,而同樣的濃度使用熒光PCR時,則均出現擴增曲線,Ct值隨著濃度的降低依次遞減(見圖8、表3),均出現熔解曲線的特征峰,可以檢測出0.01 ng/μL濃度的陽性樣品。對于人工模擬污染樣品使用SYBR Green I方法檢測,結果如圖9,10%、1%、0.1%的樣品均出現擴增曲線,且Ct值與Tm值符合預期,表明該方法能夠在其他基質混合的樣品中檢測到牡蠣含量為0.1%的樣品。

圖9 人工污染模擬樣品牡蠣成分熒光PCRFig.9 Real-time PCR for low concentration oyster samples注:從左到右牡蠣濃度依次為陽性樣品、10%、1%、0.1%牡蠣含量樣品。

圖8 牡蠣成分熒光PCR檢測靈敏度Fig.8 Detection sensitivity of real-time PCR sensitivity for oyster samples注:從左到右牡蠣濃度依次為100、50、12.5、3.125、0.78、0.2、0.1、0.05、0.025、0.01 ng/μL。

圖7 牡蠣成分普通PCR檢測靈敏度Fig.7 Detection sensitivity of normal PCR for oyster samples注:1～10:牡蠣濃度分別為100、50、12.5、3.125、0.78、0.2、0.1、0.05、0.025、0.01 ng/μL;11:陰性對照;12:空白對照。

表3 檢測靈敏度Ct值Table 3 Ct of detection sensitivity

結果表明普通PCR的方法能夠滿足一般樣品的檢測,可作為結果確認的一種方法。而SYBR Green I實時熒光PCR的檢測檢出限更低,具有更高的靈敏度,通過熔解曲線可以排除一些非特異性擴增,能夠滿足更低濃度人工模擬污染樣品的檢測,所以選擇此方法進一步對牡蠣相關產品進行實驗。

在分析樣品是否陽性時,要結合Ct值與熔解曲線進行判定,當Ct值小于35時且具有特異的Tm值時,樣品牡蠣成分為陽性;當Ct值小于35,而無特異的Tm值時,應重復檢測進行確證;當Ct值大于35,且無特異的Tm值時,樣品牡蠣成分為陰性。

2.5 不同牡蠣產品的檢測

運用建立的熔解曲線方法對市場收集的海蠣干、海蠔罐頭、蠔油、蠔汁、牡蠣粉等樣品進行檢測,樣品類型和檢測結果見(見表4、表5),實驗中幾種即食產品(牡蠣干、牡蠣罐頭)的Ct值<35且熔解曲線Tm值與牡蠣陽性樣品相符((80.08±0.4) ℃),通過電泳驗證也證實含有牡蠣成分;在牡蠣類保健品中,牡蠣粉都能檢測出牡蠣成分,而部分膠囊和藥片(成分為牡蠣提取物)的產品未能檢測出牡蠣成分。對于深加工食品的檢測效果,部分蠔油中檢測到了信號微弱的牡蠣特異峰,然而樣品中的Ct值與Tm值均不能同時符合陽性標準,因此未檢測出牡蠣源性成分。

表4 牡蠣制品檢測結果Table 4 Test results of oyster products

表5 牡蠣制品檢測Ct、Tm值Table 5 Ct and Tm results of oyster products

3 結論

本試驗利用普通PCR和SYBR Green I熒光PCR的方法進行分析檢測牡蠣成分,普通PCR的方法陽性樣品與陰性樣品的電泳結果以及測序結果均與預期相符,而熒光PCR的檢出限達到了0.01 ng/μL,同時適用于低濃度樣品的檢測,能夠檢測出牡蠣成分含量為0.1%的樣品。通過結合Ct值與熔解曲線的特征峰Tm值分析,SYBR Green I熒光PCR的方法能更快的分析得到結果,不僅操作安全方便,檢測方法特異性高,而且可以降低檢測成本。針對容易出現非特異性擴增的樣品(蛤蜊、扇貝)等樣品進行檢測,通過調整退火溫度后,也具有良好的效果。

通過對牡蠣干、牡蠣粉等牡蠣食品及相關產品的檢測,證明這本方法可以快速檢測出過敏原牡蠣成分,其中對于收集到的食品相關產品以及保健品中牡蠣粉的檢出率為100%。而對于深加工產品(如耗油、蠔汁)的檢測中,可能影響結果的原因有:不同的蠔產品前處理方式不同,而且深加工樣品DNA在加工過程中破壞較為嚴重導致提取出的DNA質量不高。樣品在加工過程中添加的各類高鹽、高滲類輔料對PCR反應產生抑制。樣品中牡蠣成分添加量較低或未添加。由此造成提取DNA比較困難,得到的DNA質量也比較差,導致不能檢測出牡蠣源性成分。在今后的實驗研究中一方面需要對深加工樣品進行前處理的優化,另一方面初步建立了探針和環介導等溫擴增Lamp技術的方法進行比較檢測,Lamp方法試驗條件簡單,更適合于現場在線檢測。