2,4二硝基氟苯柱前衍生HPLCUV法測定海稻米中的γ氨基丁酸含量

段智紅,黃永梅,呂應年,,*,梁力中,黃燕霞,葉 華,,葉盛權

(1.廣東醫科大學,廣東天然藥物研究與開發重點實驗室,廣東湛江 524023;2.廣東醫科大學,海洋醫藥研究院,廣東湛江 524023;3.廣東海洋大學,食品學院,廣東湛江 524088)

海水稻(海稻86)是生長于海邊灘涂的一種耐鹽堿水稻,由野生水稻繁育,國家農業部2014年公布于《農業植物新品種保護公報》,是一種特異性水稻種質資源[1-2]。海水稻營養成分豐富,含多種蛋白質、脂肪及微量元素等,與精白米相比,海稻米的膳食纖維及多酚類物質含量高而淀粉含量低。海稻米口感粗糙,不適合作主糧日常食用。海稻米經培育發芽,能提高活性成分γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)的含量,因此發芽海稻米可用作生產高含量GABA功能性食品的原料。GABA是一種非蛋白質氨基酸,廣泛存在于動物、植物、真菌等各種生物體中,在哺乳動物中主要存在于中樞神經系統,具有抑制中樞神經、增強肝腎功能、降血壓及降血脂等生理活性[3-4]。GABA作為一種新型功能性因子可應用于醫藥、食品、保健品等生產領域[5]。為了開發和評價富含GABA的功能性食品,發展一種高效、準確的檢測方法已是當務之急。

傳統的檢測方法有化學比色法和層析法[6-7],操作簡便,成本較低,但由于米胚芽樣品成分復雜,含有多種游離氨基酸,能和顯色劑發生化學反應,干擾顯色,造成結果不準確。現代的檢測方法有氨基酸自動分析儀檢測法[8]、高效液相色譜-熒光分析法[9]、高效液相色譜-質譜分析法[10],檢測迅速、結果精確,但由于這些儀器設備昂貴,常規分析實驗室難以配置,限制了方法的應用。

高效液相色譜-紫外檢測器分析是大多數實驗室配置的常規儀器,但GABA分子沒有紫外吸收官能團,往往需要柱前衍生化,在GABA分子上結合具有紫外吸收的化合物,從而能被紫外檢測器發現。常用的衍生化試劑有6-氨基喹啉基-N-羥基琥珀酰亞胺基甲酸酯(AQC)、丹磺酰氯(DNS-Cl)、2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)、9-芴基甲基氯甲酸酯(FMOC)以及鄰苯二甲醛(OPA)等,但存在反應條件苛刻、衍生產物不穩定、試劑毒性大等缺點[11-12]。

2,4-二硝基氟苯(FDNB)是一種反應活性高、價廉的衍生劑,FDNB與氨基反應迅速、結合牢固,衍生產物具有紫外吸收且相當穩定,是進行柱前衍生反應的理想試劑[13]。本研究以FDNB為衍生劑,建立一種快速準確的檢測方法,用于測定海水稻及發芽海水稻的GABA含量。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

精白米及玉米 廣東省湛江市區農貿市場;海稻米 來自陳日勝研究員饋贈;γ-氨基丁酸標準品(≥99%)、2,4-二硝基氟苯(FDNB) 美國Sigma公司;乙腈(色譜級) 天津市科密歐化學試劑有限公司;其它化學試劑 均為分析純;水 為實驗室超純水機制水。

Agilent 1260高效液相色譜儀 美國安捷倫科技公司;OBS-2200旋轉蒸發儀 上海愛朗儀器有限公司;AR224CN型分析天平 梅特勒-托利多儀器上海有限公司;pHB-3筆式pH計 上海三信儀表廠;HX-200型高速中藥粉碎機 浙江省永康市溪岸五金藥具廠;TDZ4臺式低速離心機 湖南赫西儀器裝備有限公司;DZG-303A超純水機 上海碩鼎水處理設備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 發芽海稻米的培育 將保留有完整米胚的海稻米用水浸泡24 h,轉移至稻米發芽專用平底盤內,平鋪,濕紗布覆蓋,每6 h噴水保濕,保持室溫25～35 ℃靜置發芽。根據發芽時間24、48、72 h取樣,提取并檢測樣品中GABA含量。

1.2.2 GABA提取 試驗用精白米、玉米及海稻米經HX-200型高速中藥粉碎機粉碎得米粉樣品,準確稱取米粉樣品各3 g,加入50 mL 60%的乙醇超聲(60 ℃,50 Hz)提取2 h,離心(4000 r/min,10 min,37 ℃)取上清液,用旋轉蒸發儀濃縮(60 ℃,30 min),用流動相0.5%醋酸銨水溶液-乙腈(85∶15,V∶V)混合溶液定容至25 mL,用孔徑為0.22 μm的有機濾膜過濾。

1.2.3 樣品衍生化 取7份1.2.2中發芽的海稻米濾液,每份3 mL于5 mL EP管中,加入0.3 mL NaHCO3(0.5 mol/L)溶液,向EP管中分別加入0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL的0.715 mg/mL FDNB的乙腈溶液,混勻,避光于60 ℃水浴1 h,冷卻至室溫后10000 r/min離心10 min,取上清定容至5 mL,0.22 μm濾膜過濾后備用。

1.2.4 色譜條件的優化 色譜系統采用安捷倫1200型高效液相色譜儀。色譜柱為Thermo Hypersil C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),檢測波長360 nm,柱溫30 ℃,進樣量10 μL,流速1.0 mL/min。根據文獻方法篩選流動相,比較乙腈-磷酸鹽溶液流動相和乙腈-醋酸銨溶液流動相的分離情況,優化樣品中GABA的色譜分離條件,并分別用蒸餾水和硼酸鹽緩沖液對衍生化后發芽24 h的海稻米粉樣品進行不同倍數稀釋(1、5、10、20、40倍),之后各取10 μL注入高相液相色譜儀中進行分析,考察樣品溶液pH對色譜分離的影響。

1.2.5 標準曲線的繪制 精密稱取0.00393 g GABA標樣于10 mL容量瓶中,用超純水定容至刻度線,配制成0.393 mg/mL的GABA標準溶液,備用。取3 mL標準溶液,按照1.2.3項方法衍生化處理,過濾。將衍生化后的GABA溶液稀釋成1.178、5.89、11.79、17.68、23.58 μg/mL倍配成五個不同濃度,分別取10 μL注入高效液相色譜儀分析,以峰面積為縱坐標(Y),以GABA濃度(μg/mL)為橫坐標(X)繪制標準曲線。

1.2.6 精密度實驗 精密稱取0.02000 g GABA標樣于10 mL容量瓶中,用超純水定容至刻度線,配制成2 mg/mL的GABA標準溶液,取3 mL標準溶液按照1.2.3項方法衍生化處理,過濾。

1.2.7 重復性實驗 取發芽24 h的海稻米粉濾液,按照樣品處理的方法,分別同時制備6份樣品溶液進行測定。

1.2.8 穩定性實驗 精密稱取0.00393 g GABA標樣于10 mL容量瓶中,用超純水定容至刻度線,配制成0.393 mg/mL的GABA標準溶液,備用。取3 mL標準溶液按照1.2.3項方法衍生化處理,過濾。

1.2.9 加標回收率實驗 取1.2.2中試驗用精白米、玉米及海稻米的提取液各3 mL,分別加入3.245、3.468、2.910、6.543和11.453 μg/mL的GABA標準品溶液,按照1.2.3下方法制備樣品液。

1.2.10 不同樣品GABA含量測定 試驗用精白米、玉米以及海稻米按前述方法粉碎、提取GABA、衍生化后,離心、過濾,取濾10 μL進樣HPLC,在優化的色譜條件下分離檢測,優化的色譜條件為Thermo Hypersil C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),檢測波長360 nm,柱溫30 ℃,進樣量10 μL,流速1.0 mL/min。峰面積代入標準曲線計算樣品中GABA的含量。

1.3 統計學分析

2 結果與分析

2.1 衍生條件(FDNB投量)的優化

GABA分子的氨基取代FDNB分子上的氟原子生成二硝基苯胺衍生物(化學反應方程式如圖1),能被紫外光檢測。

圖1 GABA和FDNB的衍生化反應方程式Fig.1 Derivatization reaction of GABA and FDNB

若衍生反應中FDNB的量不足,則樣品GABA不能完全轉化成紫外吸收物質,影響結果的準確性,因此在衍生化反應中,FDNB的量應能確保GABA完全反應。根據茚三酮顯色預實驗發現,經24 h培育的發芽海水稻GABA含量最高,在衍生化反應中,逐漸添加FDNB的反應體積,確定可完全反應的最小加入量。當樣品量為3 mL時,衍生劑FDNB加入0.1～0.3 mL時,GABA生成量逐漸增加,當FDNB體積繼續增加到0.3～0.6 mL時,產物峰面積基本不變,表明樣品中GABA已經完全反應,結果如圖2。由此可見,衍生劑的加入量為0.3 mL,可確保樣品GABA完全反應,紫外檢測結果準確可靠。

圖2 0.715 mg/mL FDNB投量的優化Fig.2 Optimization of the addition volume of FDNB at 0.715 mg/mL

2.2 色譜條件優化

色譜法測定GABA的常用流動相為乙腈-水-磷酸鹽體系[14],梯度洗脫,分離時間較長[15]。在優選流動相預實驗中,使用乙腈-磷酸鹽體系洗脫,高效液相色譜儀存在泵壓不穩定的現象,洗脫過程中泵壓突然急劇降低,原因在于乙腈和磷酸鹽溶液的在線混合過程中,有微量磷酸鹽從乙腈有機相中析出,造成泵壓不穩定。經篩選發現,采用乙腈-醋酸銨作為流動相,泵壓平穩,GABA分離度高(R>1.5)結果如圖3。

圖3 不同樣品的色譜圖Fig.3 Chromatograms of reference substance注:(a)GABA標樣;(b)發芽海稻米24 h;(c)FDNB溶液。

發芽海稻米中GABA色譜峰保留時間為15.8 min,與GABA標樣色譜峰保留時間(15.9 min)基本一致,FDNB溶液的色譜峰保留時間是6.1 min,且FDNB溶液的其他成分GABA無干擾,這表明該條件下,GABA的分離效果較好。

預實驗發現樣品及流動相的pH對色譜分離有顯著影響。樣品衍生化反應完畢,反應液需稀釋后進樣HPLC分析,稀釋溶液的pH會影響色譜峰的保留時間。圖4中A和B分別是用蒸餾水和硼酸鹽緩沖液對衍生化后的樣品按不同倍數稀釋得到的色譜圖(縱坐標為mAU),結果顯示,用蒸餾水稀釋1、5、10、20、40倍樣品,GABA色譜峰的保留時間分別為24.8、23.1、20.9、19.4和14.0 min,發生明顯漂移;用硼酸鹽緩沖液稀釋的樣品中GABA色譜峰保留時間都在15.8 min,幾乎不漂移,表明pH是影響樣品中GABA色譜峰漂移的關鍵因素。本試驗采用的流動相乙腈-醋酸銨水溶液呈堿性,因此稀釋液采用硼酸鹽緩沖液,樣品溶液pH穩定在9.0左右,色譜峰保留時間不漂移。

圖4 不同溶液稀釋樣品所得色譜圖Fig.4 Chromatograms of GABA derivatives soiluted by different solution注:A：蒸餾水稀釋；B:硼酸鹽緩沖液稀釋。

2.3 標準曲線

按照實驗設計,準確配制不同濃度衍生化的GABA標準溶液進行色譜分析,以峰面積為縱坐標(Y),以GABA濃度(μg/mL)為橫坐標(X)繪制標準曲線,見圖5。

圖5 GABA對照品的標準曲線Fig.5 Calibration curve of GABA reference

經過數據分析,GABA標準曲線的回歸方程為Y=41.344X-4.0243,相關系數R2=0.9999。這說明待測液中GABA含量在1.18～23.58 μg/mL的范圍內與吸光度的相關性較好。

2.4 精密度、重復性及穩定性

精密吸取處理后的2 mg/mL GABA標準溶液10 μL,進樣,平行測定6次,以峰面積考察其精密度,實驗結果顯示標準偏差(SD)為6.60,相對標準偏差(RSD)為0.08%,表明儀器精密度良好。

取發芽24 h的海稻米粉樣品,按照樣品處理方法同時分別制備6份樣品溶液進行測定,以GABA含量考察重復性,SD值為4.11,RSD值為0.66%,遠低于2%,證明該方法具有良好的重現性。

取衍生化的標準液,分別于0、4、8、12、24 h進樣,測定GABA含量。測定結果顯示,GABA峰面積的SD值為7.75,RSD值為0.60%,表明GABA衍生產物在24 h內穩定。

2.5 加標回收率實驗

取1.2.9中各樣品溶液反復進樣3次,進樣量10 μL,分別測定它們的平均回收率為99.480%、99.295%、100.361%、101.358%、101.233%;RSD值分別為1.721%、1.658%、1.835%、1.924%、1.800%,均小于15%,結果見表1。這表明該方法下測得的樣品含量準確可靠。

表1 加樣回收率試驗結果(n=3)Table 1 Result of recovery test(n=3)

2.6 樣品含量測定

用上述方法檢測幾種糧食樣品的GABA含量,結果顯示,精白米中幾乎不含GABA,玉米的GABA含量是3.74 μg/mg,海稻米GABA含量是3.63 μg/mg,海稻米發芽24、48、72 h樣品中GABA 的含量分別是34.35、17.03和9.54 μg/mg。實驗結果見圖6。

圖6 各樣品中GABA含量圖Fig.6 GABA content of each sample

3 討論與結論

文獻中報道的GABA的測定方法中主要有比色法[16-17]、紫外分光光度法[18]、氨基酸分析法[19]和高效液相色譜法[20],前兩種方法主要用于測定成分較復雜的物質中的GABA,測定結果容易受干擾而影響結果的準確性。而氨基酸分析法無論是柱前或是柱后衍生化,檢測時大多用的是熒光檢測器,成本高,價格昂貴。由于GABA分子沒有紫外吸收官能團,不能直接用于高效液相法檢測,往往需要衍生化。衍生化試劑多種多樣,因此,檢測方法也各有不同,但都有不足之處。常用的方法有OPA法[21]、DNS法[22]、PITC法[23]、CEOC法[24]和FDNB法[25-26]。OPA法衍生物穩定性差,測定結果不準確;DNS法、PITC法、CEOC法這三種方法反應速度慢,反應試劑易對實驗結果造成干擾。用FDNB作為衍生化試劑時不僅反應速度快、衍生物穩定,且靈敏度高,干擾物少,方法簡單易行,且本實驗克服了pH影響色譜峰漂移的問題,測定結果更穩定、準確、可靠,是一種理想的檢測方法。

本研究建立了一種檢測海稻米中GABA含量的HPLC方法,采用FDNB進行了柱前衍生,優化了FDNB的投量并確定FDNB的最佳投量為0.3 mL,以0.5%醋酸銨水溶液∶乙腈(V∶V)=85∶15作為最優色譜條件,解決泵壓不穩的問題;用四硼酸鈉緩沖液(pH=9.0)作為稀釋劑,確保GABA色譜峰保留時間不變。結果表明,GABA含量在1.18～23.58 mg/mL范圍內線性關系良好,各樣品中GABA含量測定結果為發芽海稻米24 h>發芽海稻米48 h>發芽海稻米72 h>未發芽海稻米和玉米>精白米。由此可見,海稻米在發芽初期24 h內,其GABA含量大幅增加,約為未發芽海稻米的10倍,這可能是由于發芽過程中,谷氨酸在內源性蛋白酶和谷氨酸脫羧酶的共同作用下產生了GABA,但隨著發芽時間的繼續延長,GABA的含量開始下降,這也許是生成的GABA又在轉氨酶的催化下形成琥珀酸半醛而逐漸被消耗,導致GABA含量下降[25-28],因此,合理地控制海稻米的發芽時間是提高海稻米中GABA含量的關鍵因素。