蘋果濁汁云狀顆粒體系穩(wěn)定機制研究進展

朱丹實,任曉俊,魏立威,劉 賀,*,李賀文,曹雪慧,郭 迪,勵建榮,*

(1.渤海大學食品科學與工程學院,遼寧省食品安全重點實驗室,生鮮農產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術國家地方聯(lián)合工程研究中心,遼寧錦州 121013;2.錦州市三寅食品有限公司,遼寧錦州 121013)

我國是蘋果生產(chǎn)大國,蘋果產(chǎn)量連年攀升。2015年蘋果產(chǎn)量已達4261.3萬噸[1],同比2014年的4092.3萬噸增加了4.13%。將蘋果加工為即食的果汁產(chǎn)品,既可以提高商品的附加值,也可以滿足人們快速生活節(jié)奏的要求。而穩(wěn)定性不佳和易褐變一直制約蘋果濁汁產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[2]。在褐變控制方面,目前國內外主要通過加工過程中添加VC等抗氧化劑、減少氧氣接觸以及加熱等手段控制酶促及非酶褐變[3-4]。而混濁穩(wěn)定性方面,雖然可以通過均質、添加穩(wěn)定劑、改變粒子的電負性等手段加以改善,但始終沒有得到根本解決。

蘋果濁汁富含的多酚及果膠類物質具有抑菌、抗氧化等多種生物活性[5-6],在抵抗心血管疾病、糖尿病、肥胖和癌癥方面都表現(xiàn)出良好效果[7]。伴隨濁汁的失穩(wěn),是營養(yǎng)物質的損失。研究表明,蘋果濁汁對二甲肼誘發(fā)小鼠結腸癌具有明顯的預防效果,而分離獲得的蘋果多酚單體無此功能;蘋果濁汁在抑制致癌物誘導的上皮細胞增殖和DNA傷害方面比清汁更有效[8-9]。蘋果果膠和多酚共同飼喂小鼠對其脂質代謝具有比單獨飼喂更好的效果,說明二者具有一定的協(xié)同效應[10]。近年來,蘋果濁汁的研究多集中在抑制氧化酶活性[11-12]及微生物的滅活[13-14]方面,而對蘋果濁汁穩(wěn)定性方面關注較少。本文綜述了蘋果濁汁中具有起云特性的云狀顆粒物體系的構成,聚集和失穩(wěn)過程,以及云狀顆粒體系穩(wěn)定的主要影響因素,可為提高和維持蘋果濁汁的云狀穩(wěn)定性提供理論借鑒。

1 蘋果濁汁云狀顆粒體系的構成

蘋果濁汁體系的溶劑主要由糖、果膠、有機酸及其鹽溶液組成,顆粒體系一般認為是以帶正電的蛋白質為核心,果膠分子吸附其上[15]。蘋果濁汁中顆粒因光散射形成了果汁的混濁狀態(tài)[16]。濁汁制備階段形成的顆粒體系因尺寸較小及靜電斥力作用可短期內穩(wěn)定[17]。借助醋酸鈾負染色電子顯微鏡發(fā)現(xiàn)濁汁霧狀物主要是由大小不一的球狀顆粒組成的支鏈狀聚集體,如圖1所示。

圖1 負染色的蘋果汁顆粒結構[18] Fig.1 Haze particle structures by negative stained formed in apple juice注:1a=1 μm;1b～1c=10 μm。

果汁云狀顆粒體系構成具有相似性。對楊梅汁云狀體系微觀結構的研究表明,云狀體系中顆粒為球形和橢圓形并被半透明膜包圍。透射電鏡研究表明,顆粒有三個亞結構,該“核心”和云狀物的中間部分為多酚或 多酚/蛋白質復合物[19]。蘋果濁汁顆粒物組分(Cloudy Particle Components,CPC)主要包括多酚、蛋白和果膠。不同原料來源蘋果濁汁云狀成分配比不同,總體來看,云狀顆粒物組分CPC含量占30.0～72.5 mg/100 mL,其中蛋白為5.0～15.0 mg/100 mL,果膠為2.5～62.5 mg/100 mL,多酚類物質為11.0～17.5 mg/100 mL[8,20]。Zhao等[21-22]研究蘋果汁膜過濾性能的影響中發(fā)現(xiàn),蘋果濁汁中膠體顆粒主要有兩種尺寸,中心粒徑分布分別為1和5 μm左右。蘋果濁汁中可溶性果膠含量、蛋白質/酚類復合物的形成、酚類的氧化聚合等都影響CPC的構成和顆粒大小[23]。而CPC對于蘋果濁汁的顏色、風味及流變學特性也起關鍵作用[24]。

蘋果果膠是一類具有不同分子量的多糖。不同分子量的果膠有著不同的理化性質,如半乳糖醛酸含量、酯化度、黏均分子量、透光率、吸光度等均有所不同。果膠分子的主鏈是150～500個α-D-半乳糖醛酸基通過1,4糖苷鍵相連接而成的,在主鏈中相隔一定距離含有α-L-鼠李糖基側鏈。氣相色譜分析表明[25],蘋果果膠中除了半乳糖醛酸外還含有8種單糖,分別為鼠李糖、巖藻糖、果糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖。仇農學等[26]利用超濾法分離得到6種不同相對分子質量的蘋果果膠,其中相對分子質量大于30萬的占大多數(shù),達到68.04%,相對分子質量在5000以下的較少,只有3.31%。蘋果果膠隨著相對分子質量的減小,果膠的半乳糖醛酸含量隨之降低,但5000～10000 kD的果膠半乳糖醛酸含量較高。隨著蘋果果膠分子量的降低,酯化度也隨之相應降低,但是各種分子量蘋果果膠仍為高酯果膠。不同提取方法獲得的蘋果果膠性質差別較大,目前蘋果果膠主要從蘋果果渣中提取,而對蘋果汁中果膠類物質的結構和性質分析研究較少。

蘋果多酚包括多種酚類物質,可分為酚酸及其羥基酸酯類、糖類衍生物和黃酮類化合物(如兒茶素、表兒茶素、原花青素、二羥基查耳酮、黃酮醇配糖體等)[27]。陜西師范大學的鄧紅等[28]利用高效液相色譜指紋圖譜技術鑒定了10個批次不同來源蘋果濃縮汁中多酚物質,從多酚的12種共有峰中標定了7種單體酚,分別是沒食子酸、4-羥基苯甲酸、兒茶素、綠原酸、咖啡酸、表兒茶素和根皮苷。近年來,在根皮苷對蘋果汁的褐變[29]及摻偽檢測[30]方面研究較多。與蘋果汁混濁相關的多酚只占蘋果多酚的很少一部分。Siebert等[31]發(fā)現(xiàn)蘋果濁汁沉淀物中有兒茶素和原花青素的聚合體[31]。苑博等人[32]利用超高效液相色譜(UPLC)鑒定出蘋果汁中的主要多酚類物質分別為沒食子酸(18.39 mg/L)和綠原酸(52.10 mg/L),在長期低溫保藏其含量有所下降。而Ana L. Ramos-Aguilar等人的研究表明[33],在蘋果汁加工過程中總酚和單體酚含量都有所增加。

起云活性蛋白(Haze-Active Proteins,HAP)是指和混濁有關的蛋白質,其自身或與酚類之間的相互作用是造成果汁后混濁的重要因素。蛋白質/酚類化合物的聚合也是澄清蘋果汁后混濁的主要原因[34]。能形成此類聚合物的蛋白質只占其總量的一小部分,據(jù)報道,分子量12、15、28[35]、25[36]和36 kDa[37]的蛋白與蘋果汁的后渾濁有關,且脯氨酸和羥脯氨酸等疏水性氨基酸含量越高,起渾能力越強[38]。

2 云狀顆粒物的聚集及失穩(wěn)

蘋果濁汁中由多酚/蛋白/多糖構成的云狀顆粒物組分(CPC)在貯藏過程中逐漸聚集、失穩(wěn),其聚合過程非常復雜。多酚具有多羥基結構使其具有較強的親水能力,富含脯氨酸的起云活性蛋白與多酚通過氫鍵及疏水相互作用締合[22],并對蛋白質的功能性質產(chǎn)生影響。Beveridge等[34]認為蛋白質和酚類化合物的聚合物是蘋果汁發(fā)生混濁的主要原因。由于多酚的氧化,形成了一個復雜系統(tǒng),其氧化物相互作用、相互交聯(lián),同時與蛋白質相互作用,形成了混濁和沉淀。氧化催化是形成蛋白質-酚類聚合物的關鍵因素,但聚合物的形成與蛋白質和酚類化合物的類型有關。大分子酚類化合物如縮合單寧是形成蛋白質-酚類聚合物的主要酚類化合物。蛋白質和多酚依據(jù)氫鍵、離子鍵、疏水鍵相互作用,二者的比例也影響聚合物的量。果膠與多酚通過氫鍵、疏水作用和靜電作用相結合[39]。蛋白與果膠也可以通過共價和非共價相互作用,進而影響蛋白質的界面活性和其他功能性質[40]。

Siebert等[31]推測蘋果濁汁中的兒茶素和原花青素首先通過自身聚合或者氧化,聚合體再與蛋白質相互作用,導致果汁混濁。茶飲料的后渾濁現(xiàn)象也主要是由于蛋白和多酚的聚集導致,對該體系的起渾過程研究較為深入。對茶飲料后渾過程研究表明[41],多酚/蛋白交互作用的第一階段主要通過芳香環(huán)的堆疊產(chǎn)生的疏水作用形成可溶性的多酚多肽復合物;第二階段,多個多酚分子與多肽結合,并通過分子間的協(xié)同作用形成多酚包被多肽狀態(tài),同時復合物大小倍增,并發(fā)生相變;第三階段,少數(shù)多肽二聚體克服了分子間的電荷排斥而相互聚合;最終,復合物變成更大團聚體,并從液相分離沉淀。蛋白質和多酚的比例、pH及溫度等都影響氫鍵、離子鍵和疏水相互作用的過程,進而影響聚合物的形成[42]。

Scollary等[43]研究了紅酒中蛋白質、原花青素和多糖之間的相互作用方式,可為蘋果濁汁CPC研究提供理論參考,如圖2所示,虛線表明氫鍵位點結合,雙箭頭表示疏水相互作用區(qū)域。多糖和多酚間同樣存在疏水相互作用,但作用位點尚不清楚。

圖2 蛋白質、原花青素和多糖片段之間的相互作用示意圖[43]Fig.2 Representation of interactions between protein,proanthocyanidin and polysaccharide fragments

蘋果濁汁中CPC微粒在果汁這種膠體體系中震蕩運動,不可避免地因相互碰撞增大其尺寸。此外,果汁中可溶性物質可能因多種復雜因素而轉化成不溶的新顆粒,直接或間接促成或增大原有顆粒尺寸。因而,隨貯藏時間的延長,蘋果濁汁中CPC顆粒逐漸聚集成復雜的分形結構,進一步變大、沉降,其膠體顆粒結構見圖3。同時,蘋果濁汁中果膠類物質會隨著儲藏時間的延長和溫度的升高而有所降解,結合其他因素使果汁的粘度降低,最終導致果汁變清、分層等混濁穩(wěn)定性喪失現(xiàn)象的發(fā)生[45]。

圖3 蘋果汁膠體聚集顆粒的SEM圖像[44](2 μm)Fig.3 SEM image of colloidal aggregates in apple juice[44](2 μm)

3 云狀顆粒體系穩(wěn)定的影響因素

從物理化學學角度來看,蘋果濁汁體系可認為是膠體系統(tǒng),其流變學特性取決于液相和固相特性。作為固相的CPC的顆粒尺寸、性狀、容積率、電粘效應、果汁的修飾粘度等均影響膠體穩(wěn)定性[46]。目前嘗試保持濁汁穩(wěn)定性的主要手段包括均質以降低顆粒粒徑,添加穩(wěn)定劑以增加果汁黏度[47],或增加果汁中懸浮顆粒負電荷以強化顆粒間斥力[16]。但降低粒徑無法解決其在貯存期聚集增長的問題,通過添加穩(wěn)定劑提高黏度改善濁汁穩(wěn)定性也有局限,過高黏度會降低產(chǎn)品的感官品質。下面介紹幾個較為重要的穩(wěn)定性影響因素。

3.1 酸度

蘋果汁的酸度對出汁率、風味、色澤、澄清度等重要參數(shù)均有影響[48]。蘋果汁中的有機酸主要為蘋果酸,并含有少量檸檬酸和奎寧酸[49]。Siebert等[42]認為多酚化合物主要與富含脯氨酸和羥脯氨酸的蛋白結合,形成蛋白-酚類聚合物,它的形成與pH、乙醇含量、溫度有關。Yi等[50]認為蘋果汁較低pH降低會加劇了多糖的水解作用。果膠類多糖作用于多酚/蛋白的聚集體,一定程度上可抑制其聚集沉淀。然而根據(jù)Zhao等[22]的研究,在低溫、較低pH和高濃度條件下,隨著果膠含量的增加,果膠顆粒之間也會通過氫鍵和疏水相互作用而發(fā)生聚集。

Thongkaew等[51]研究了多酚物質(兒茶素/丹寧)與乳清分離蛋白或乳清分離蛋白/果膠復合物的相互作用的機制,如圖4所示,環(huán)境pH影響著多酚與蛋白的聚合進而影響蛋白質的沉淀,果膠與蛋白的可形成絡合物從而減少蛋白沉淀。Mateus等[52]對葡萄籽多糖與蛋白相互作用的研究,認為其多酚保護機制有兩種可能,一是帶電多糖/蛋白質/單寧聚合形成三元復合物以增強溶解性;二是多糖與單寧發(fā)生分子締合,從而競爭性抑制其與蛋白質的聚集。

圖4 多酚(PP)與蛋白(P)及果膠(PE)凝聚物相互作用的可能機制[51]Fig.4 Possible mechanism implicating polyphenol interactions with protein and proteinepectin coacervates

3.2 離子強度及帶電性質

對于蘋果濁汁體系,分散的膠體粒子間的靜電斥力和水合作用對蘋果濁汁的粘度影響很大[53]。Benítez[17]研究了液體介質的pH和離子強度對蘋果汁顆粒穩(wěn)定性的影響,作者采用擴展DLVO理論對膠體相互作用進行建模,并成功應用于果汁穩(wěn)定性和黏度的預測。Ellerbee等[54]對橙汁穩(wěn)定進行性的研究發(fā)現(xiàn),草酸銨通過螯合鈣離子阻止因果膠分子交聯(lián)而引起的混濁橙汁云狀體系的失穩(wěn),橙汁粒子尺寸受pH和貯藏時間的影響,這說明除了鹽橋作用,云狀體系中顆粒間的非共價和非靜電相互作用力同樣發(fā)揮作用。根據(jù)Xiang等[55]的研究,蘋果汁的帶電性質對果汁的可溶性固形物、還原糖、總酚等也會有一定影響。

3.3 溫度及酶的作用

溫度會影響濁汁體系中酶的活性、蛋白與酚類物質的聚合、果膠的溶解性等,進而影響蘋果濁汁的穩(wěn)定性。雖然Paepe等[56]的研究表明,高溫會使蘋果濁汁中的酚類化合物降解,且溫度越高降解越多。但是較高溫度可以使有能力形成蛋白-酚類化合物的蛋白暴露更多的結合位點,從而形成更多的蛋白-酚類聚合物。蘋果內源果膠甲酯酶(PME)可使果膠脫去部分甲基,使其擁有更多負電荷并緊密包裹蛋白質核,增強果汁的混濁穩(wěn)定性。但是酶作用過度,則形成低甲氧基果膠易與金屬離子形成凝膠而影響混濁穩(wěn)定性。此外,低甲氧基果膠容易被蘋果內源性果膠酶(PG)水解,蛋白質核暴露導致顆粒的靜電聚集[3]。用商業(yè)果膠酶處理,雖然可提高蘋果濁汁的得率和多酚含量,但會降低果汁粘度和云度[57]。

4 展望

蘋果濁汁云狀顆粒物組分主要包含蛋白質、多酚和果膠類多糖,但這些組分構成云狀體系的具體形式尚不明確,其加工及貯藏過程中會失去穩(wěn)定性而導致聚集的機理也未完全明晰,這些都需要科研人員繼續(xù)深入研究。今后,蘋果濁汁穩(wěn)定性機理研究應重點從蘋果濁汁三元復合體系的精細結構及失穩(wěn)過程著手,如:云狀顆粒體系的形成過程,蛋白/多酚/果膠的具體分子結構及交互作用方式,濁汁顆粒體系與溶液的作用關系及在溶液中失穩(wěn)過程等方面開展深入研究。這些機理方面的研究,有助于揭示蘋果混濁汁中云狀顆粒物的結構及穩(wěn)定性影響機制,為推動蘋果混濁汁產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展奠定理論基礎。