莖瘤芥新鮮種子總RNA提取研究

□ 符純愿 鄭曉華 林涵梅 廣東省食品工業(yè)研究所有限公司

1 引言

1.1 研究背景、目的及意義

莖瘤芥又名青頭菜，屬十字花科蕓薹屬芥菜種葉芥亞種大葉芥變種的變種，其最初由野生芥菜（Brassica juncea）進(jìn)化而來，其進(jìn)化次序是野生芥菜芥菜→大葉芥（Var. rugosa BaiLey）→筍子芥（Var. crassicauLis chen et ang）→莖瘤芥。在漫長的進(jìn)化過程中，芥菜（Brassica. Juncea Coss. and Czern）分化出許多類型和品種。由莖瘤芥制成的榨菜質(zhì)地脆嫩，風(fēng)味鮮美，營養(yǎng)豐富，具有一種特殊的風(fēng)味，具有特殊酸味和咸鮮味，脆嫩爽口，含豐富的人體所必需的蛋白質(zhì)、胡蘿卜素、膳食纖維、礦物質(zhì)等，以及谷氨酸、天門冬氨酸、丙氨酸等17種游離氨基酸。現(xiàn)今，人們對莖瘤芥所作的研究大多還停留在栽培、育種等宏觀水平上[1-4]，在分子水平上的研究還比較少。

1.2 實(shí)驗(yàn)技術(shù)路線

核酸分為DNA和RNA兩大類。根據(jù)DNA核蛋白和RNA核蛋白溶解度的研究發(fā)現(xiàn)，在氯化鈉濃度為0.41 mol/L時(shí)，DNA核酸蛋白的溶解度僅為水中的1/10，當(dāng)氯化鈉濃度增加時(shí)，DNA核蛋白的溶解度逐漸增加，氯化鈉濃度增至1 mol/L時(shí)，DNA核蛋白溶解度比水中大2倍。而RNA核蛋白在0.41 mol/L氯化鈉濃度時(shí)仍有相當(dāng)大的溶解度；當(dāng)氯化鈉濃度增大時(shí)，溶解度又相對減少目前，關(guān)于莖瘤芥種子RNA的提取還沒有明確的方法，應(yīng)用較多的有CTAB法、SDS法以及商業(yè)試劑盒Trizol等[5-6]。

CTAB法的最大優(yōu)點(diǎn)是能很好地去除糖類雜質(zhì)，所以對于莖瘤芥這類含酚類物質(zhì)及糖類物質(zhì)較高的植物材料，采用CTAB法是比較理想的。該方法的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是在提取的前期能得到高含量的DNA與RNA，可根據(jù)實(shí)驗(yàn)的需要，分別進(jìn)行純化。本次試驗(yàn)根據(jù)前人的研究，由于莖瘤芥種子含有較高的酚類物質(zhì)及糖類物質(zhì)，為了使研究更準(zhǔn)確，故采用CTAB法[7-9]。

2 材料與方法

2.1 材料

莖瘤芥種子（永安小葉，貯藏期為1年以內(nèi)），由重慶涪陵種子公司提供。

2.2 莖瘤芥新鮮種子總RNA的提取方法

2.2.1 種子消毒處理

選擇均一完好的莖瘤芥新鮮種子于培養(yǎng)皿，用2%過氧化氫浸泡5 min進(jìn)行消毒處理，消毒完成用蒸餾水沖洗數(shù)次后，徹底洗凈過氧化氫，晾干后-20 ℃冰箱下保存。

2.2.2 硫酸銅處理

取12份預(yù)處理好的種子，每份0.2 g，硫酸銅溶液的濃度為0、5、10、20 mg/L，分別用各種濃度的硫酸銅溶液對預(yù)處理好的種子在25 ℃下進(jìn)行浸種處理，每一種濃度的溶液均對種子進(jìn)行4 h、8 h、12 h處理，然后分別進(jìn)行總RNA提取研究。

2.2.3 總RNA的提取方法

取經(jīng)過氧化氫消毒的新鮮種子0.2 g放入預(yù)冷的研缽中，迅速加入2 mL預(yù)冷的提取液，快速研磨1 min，轉(zhuǎn)移至2 mL離心管中混勻，65℃溫浴30 min，期間混勻2～3次。加入0.5倍體積酚，混勻后冰浴15 min。12 000 r/min離心10 min，取上清液轉(zhuǎn)入新的離心管中，加入一倍體積酚∶氯仿（1∶1），混勻。

12 000 r/min離心10 min，取上清液裝入新的離心管中，加入一倍體積氯仿，混勻（此步驟重復(fù)2次）。

12 000 r/min離心10 min，取上清液裝入新的離心管中，加入1/3體積8 mol/L LiCl，混勻，在-20 ℃放置2 h。12 000 r/min離心10 min，棄去上清液，用70%乙醇快速洗滌，將沉淀溶解于500 μL SSTE溶液中。加入一倍體積氯仿∶異戊醇（24∶1），混勻。

12 000 r/min離心10 min，取上清液裝入新的離心管中，加入一倍體積氯仿∶異戊醇（24∶1），混勻（此步驟重復(fù)2次）。

12 000 r/min離 心10 min， 取上清液裝入新的離心管中，加入50 μL 3mol/L NaAc，混勻，再加入2倍體積無水乙醇，混勻，-20 ℃放置30 min。12 000 r/min離心10 min，輕輕棄去上清液，加入1 mL 70%乙醇洗滌。

12 000 r/min離心2 min，輕輕棄去上清液，加入1 mL 70%乙醇洗滌（此步驟重復(fù)2次）。

12 000 r/min離心2 min，棄去上清液，注意不要倒出沉淀物。離心管壁殘留液經(jīng)瞬時(shí)離心后，用洗頭吸出殘液，室溫晾干沉淀。加入25 μL已滅活的DEPC水，充分溶解RNA，-20℃保存?zhèn)溆肹10-14]。

2.3 總RNA濃度和純度的檢測方法

當(dāng)OD260/OD280比值在1.8～2.0時(shí)，認(rèn)為RNA中蛋白或者時(shí)其他有機(jī)物的污染是可以接受的，但當(dāng)OD260/OD280比值小于1.8時(shí)，溶液中蛋白或者時(shí)其他有機(jī)物的污染比較明顯，當(dāng)OD260/OD280比值大于2.2時(shí)，說明RNA已經(jīng)降解。

①計(jì)算OD260/OD280、OD260/OD230。② RNA濃 度（μg/mL）=OD260×40 μg/mL×稀釋倍數(shù)。③RNA得率（μg/g）=RNA濃度（μg/mL）×體積（mL）/取材量（g）。

3 結(jié)果與分析

3.1 瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果

從電泳圖可以看出，都有比較清晰的條帶。顯示出28S rRNA和18S rRNA 2條完整的帶型，且前者的亮度約為后者的2倍。試驗(yàn)結(jié)果表明得到的總RNA既未發(fā)生降解，又沒有DNA、蛋白質(zhì)、酚和多糖等雜質(zhì)污染,質(zhì)量和純度較高。

3.2 RNA樣品吸光度值的測定

RNA樣品在230 nm、260 nm和280 m波長處的OD值見表1。

提取所得總RNA的OD260/OD280比值在1.8～2.0，OD260/OD230比值在2.0左右是最佳比值。說明提取所得總RNA受多糖、多酚和蛋白質(zhì)等污染較少，純度較高。

圖1 總RNA瓊脂糖凝膠電泳圖

圖2 總RNA瓊脂糖凝膠電泳圖

3.3 結(jié)果與分析

從電泳圖中電泳條帶可以看出，圖1條帶亮度最清晰，其中尤其是0mg/L，8 h的處理最為明顯，無論從亮度比還是清晰度都特別明顯，OD值分析中，OD260/OD280為1.94，OD260/OD230為2.26，均達(dá)到最佳比值，因此這個(gè)處理是最佳處理。其他的電泳圖與OD值之間并沒特別明顯的規(guī)律，但總體來說，0 mg/L處理的都比其他濃度處理要清晰，可以說明硫酸銅濃度越高處理時(shí)間越長對于提取RNA有抑制的作用。

圖3 總RNA瓊脂糖凝膠電泳圖

4 小結(jié)

在提取植物種子RNA的實(shí)驗(yàn)中，一般實(shí)驗(yàn)室都是利用種子培育出幼苗葉片為材料，經(jīng)液氮研磨提取RNA。此過程必須要經(jīng)過浸種催芽、幼苗培養(yǎng)、液氮研磨等過程，一般要用兩周左右的時(shí)間才能進(jìn)行RNA的提取并進(jìn)一步開展實(shí)驗(yàn)。此方法是在實(shí)驗(yàn)條件不足的情況下通過添加提取液研磨來抑制RNase的活性，且不需要育種等培育過程，直接用處理好的種子進(jìn)行研磨，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程約在10 h即能檢測效果，能量大重復(fù)進(jìn)行，盡管效果一般，但也能提取出能進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)的RNA，對于一般性實(shí)驗(yàn)已經(jīng)足夠，可為植物RNA的提取提供新的思路。

表1 RNA樣品的OD值

圖4 總RNA瓊脂糖凝膠電泳圖