發芽糙米中粗多糖的純化及分子量測定

劉曉飛,張 宇,王 薇,關樺楠,張 娜,馬永強,*,盧淑雯

(1.哈爾濱商業大學食品工程學院,黑龍江哈爾濱 150076;2.黑龍江省農業科學院博士后科研工作站,黑龍江哈爾濱 150086)

糙米是稻谷脫去外保護皮層稻殼后的穎果,發芽糙米是糙米經過適宜的水分、溫度等外界條件發芽所得[1]。發芽糙米主要由幼芽和帶皮層的胚乳兩個部分構成[2]。發芽糙米不僅有較高的營養價值,在不同的方面也有著各種功效[3-4]。發芽糙米與糙米相比,不但感官性能和風味得以改善,而且在保留了豐富的維生素、礦物質、膳食纖維營養成分的同時,更是產生了多種具有促進人體健康和防治疾病的成分,如γ-氨基丁酸、六磷酸肌醇等[5],營養價值大大提高[6]。發芽糙米中有更多的人體所需營養成分和生理活性成分種類,具有明顯的生理活性優勢[7],因此需要更深入研究。

但是,目前對發芽糙米的研究主要集中在發芽的工藝研究、發芽糙米中淀粉的改性以及發芽糙米為原料的各種食品制作上,對發芽糙米中γ-氨基丁酸、膳食纖維、γ-谷維素等相關的研究比較多,而對其中多糖類物質研究較少[8-9]。多糖的純化過程及方法與多糖的活性具有很密切的相關性,從植物中提取的粗多糖一般都含有非多糖雜質[10]。因此需要對提取的粗多糖進行除雜,對不同的除雜方法進行篩選,篩選的原則是不僅要去除雜質的效果好,更為重要的是避免除雜方法對多糖結構和生物活性造成破壞,因此對提取出的粗多糖初步純化脫色和脫蛋白質方法上的篩選是多糖純化的重要步驟。雖然有關植物粗多糖的純化分離的研究有很多,但還沒有針對于發芽糙米粗多糖的高效的純化和分離方法。

汪艷群等[11]發現酶與三氯乙酸-正丁醇結合法比傳統單一的脫蛋白方法去除蛋白的效果更好。歐文等[12]發現Sevag法對薺菜粗多糖中的蛋白去除效果更好。從植物中提取出的粗多糖中經常含有一些色素,色素的存在會影響多糖的結構和性質的分析鑒定[13-14]。實驗室經常用活性炭、硅藻土、大孔吸附樹脂等吸附法進行脫色[15-16]。付學鵬等[17]比較了活性炭、過氧化氫等幾種脫色方法對植物粗多糖脫色的原理以及優缺點。因為活性炭等吸附劑疏松多孔的結構且無選擇性,采用吸附劑吸附脫色會使較多的多糖損失[18]。樹脂吸附是更高效的脫色方法,夏瑋等[19]采用了五種不同型號的大孔樹脂對桑葉粗多糖溶液進行脫色處理,以脫色率和多糖損失率為測量指標,分析出AB-8型號大孔吸附樹脂對桑葉粗多糖的脫色效果最好。

本實驗以脫蛋白率、脫色率和粗多糖損失率為評價指標,選出發芽糙米粗多糖脫色和脫蛋白的最佳方法,然后對經脫色脫蛋白后的發芽糙米粗多糖進行柱層析,比較三種柱層析填料對發芽糙米粗多糖的層析效果,篩選出最優柱層析填料,對柱層析后的發芽糙米多糖各組分進行分子量的測定，以期為發芽糙米粗多糖的提取、純化及分離提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

粳稻為“龍粳” 產地:黑龍江,黑審稻2011004;纖維素酶(4萬U/g)、木瓜蛋白酶(4萬U/g)、果膠酶(4萬U/g) 上海生化試劑廠;檸檬酸、磷酸氫二鈉、3,5-二硝基水楊酸、苯酚、濃硫酸 均為分析純,北京博奧拓達科技有限公司;DEAE Sepharose CL-6B、DEAE Fast Flow、DEAE Cellulose 52、Sepharose CL-6B、Sephadex G50 Pharmacia公司。

JY92-9C型微波儀 寧波新知生物科技股份有限公司;HHS-12型電熱恒溫水浴鍋 上海東星建材實驗設備有限公司;721E型紫外可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司;BS224S型電子分析天平 塞多利斯科學儀器有限公司;M288479型高速萬能粉碎機 北京東方德教育科技有限公司;TGL-16G-B型臺式高速離心機 閩南星科科學儀器有限公司；SHZ-C水浴振蕩箱 上海昨非實驗室設備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 發芽糙米粗多糖的制備 用龔谷機去除稻子外殼得到糙米,在4 ℃避光條件下儲藏。用滅菌水浸泡糙米12 h,平鋪于托盤中,置于20 ℃的培養箱發芽24 h,將發芽糙米放于85 ℃恒溫干燥箱中滅酶處理40 min,然后55 ℃干燥24 h,粉碎過篩(80目)備用。按料液體積比1∶30加入蒸餾水,100 W超聲60 min,再放入80 ℃水浴振蕩箱中震蕩4 h,在20 ℃條件下4000 r/min、離心10 min后過濾收集上清液,按1∶3加入80%～85%的乙醇,放置24 h,在20 ℃條件下8000 r/min離心15 min,收集沉淀,冷凍干燥(-25 ℃,8 h)得發芽糙米粗多糖[20]。

1.2.2 發芽糙米多糖及蛋白質的測定 采用苯酚-硫酸法[21]測定發芽糙米多糖的含量,制作葡萄糖標準曲線。將樣品準確稀釋合適的倍數,吸取2 mL樣品溶液,分別加入1 mL的6%苯酚、5 mL濃硫酸,490 nm下測量其吸光度值,代入葡萄糖標準曲線方程,計算糖含量。

采用考馬斯亮藍法[22]測定發芽糙米多糖蛋白質的含量,制作牛血清蛋白標準曲線。吸取1 mL樣品溶液,精密吸取考馬斯亮藍溶液5 mL,振蕩均勻,靜置2 min后于595 nm處測定吸光度值,代入牛血清蛋白標準曲線方程,計算蛋白質含量。

1.2.3 發芽糙米粗多糖脫蛋白方法的篩選 采用三種脫蛋白的方法對發芽糙米粗多糖進行脫蛋白,分別多次實驗,比較脫蛋白效果,得到脫蛋白三種方法最為穩定的次數。

1.2.3.1 Sevage法脫蛋白 精確配制10 mg·mL-1的粗多糖溶液,加入其體積比1∶5的三氯甲烷-正丁醇(4∶1,v/v)溶液,振搖30 min,在20 ℃條件下8000 r/min離心10 min,上清液再加入粗多糖溶液1/5體積的三氯甲院-正丁醇(4∶1,v/v)溶液,多次重復相同脫蛋白實驗步驟,直到無沉淀產生[23]。根據1.2.5計算公式計算Sevage法的粗多糖脫蛋白率、粗多糖損失率。

1.2.3.2 三氯乙酸法脫蛋白 精確配制10 mg·mL-1的粗多糖溶液,將20%的三氯乙酸和粗多糖溶液1∶1混合,振搖30 min后,冰箱放置過夜,在20 ℃條件下8000 r/min離心10 min離心,取上清液,用1 mg·mL-1氫氧化鈉溶液調至中性[24],根據1.2.5計算公式計算三氯乙酸法的多糖脫蛋白率、粗多糖損失率。

1.2.3.3 酶-Sevage法脫蛋白 精確配制10 mg·mL-1的粗多糖溶液,調pH為6,加入粗多糖溶液體積2%的木瓜蛋白酶,在水浴溫度37 ℃酶解24 h,反應完全后從37 ℃ 3 min加熱升溫至80 ℃使酶失活,在20 ℃條件下8000 r/min離心10 min離心,上清液經Sevage法脫蛋白,反復多次,直到無明顯的蛋白產生為止[25],根據1.2.5計算公式計算酶-Sevage法的多糖脫蛋白率、粗多糖損失率。

1.2.4 發芽糙米粗多糖脫色方法的篩選

1.2.4.1 活性炭吸附法脫色 活性炭經重蒸水清洗過濾,干燥(120 ℃,8 h)冷卻備用。取粗多糖配制成2 mg·mL-1的粗多糖溶液30 mL,加入1.5%的活性炭,置于恒溫45 ℃下脫色2 h,脫色可反復進行,直至顏色澄清透明或吸光值不再變化,檢測其粗多糖含量[26],根據1.2.5計算公式計算活性炭法粗多糖的脫色率、粗多糖損失率。

1.2.4.2 過氧化氫氧化法脫色 取粗多糖配制成2 mg·mL-1的粗多糖溶液30 mL,用氨水調節pH至9,加入l mL、30%的H2O2,恒溫45 ℃下脫色6 h,脫色可反復進行,直至顏色澄清透明或吸光值不再變化[27],根據1.2.5計算公式計算過氧化氫氧化法粗多糖的脫色率、粗多糖損失率。

1.2.4.3 大孔樹脂吸附法脫色 由于發芽糙米粗多糖為弱極性,所以本研究選用AB-8大孔樹脂。精密稱取經預處理的優選樹脂20 mL,濕法裝柱,柱下端塞入脫脂棉并壓平,待柱內樹脂穩定后,將4 BV的2 mg·mL-1的粗多糖溶液以2 BV的速度進行脫色,待樣品液完全進入柱內后,用2倍上樣體積的蒸餾水進行沖洗,收集脫色后液濃縮至上樣體積[28],測定并根據1.2.5計算公式計算大孔樹脂吸附法粗多糖的脫色率、粗多糖損失率。

1.2.5 發芽糙米粗多糖提取率、脫色率、脫蛋白率和損失率的計算

粗多糖提取率(%)=(粗提液中總糖含量(mg/mL)×粗提液總體積(mL))/發芽糙米粉末質量(mg)×100

粗多糖脫色率(%)=(脫色前A400-脫色后A400)/脫色前A400×100

粗多糖脫蛋白率(%)=(脫蛋白前A595-脫蛋白后A595)/脫蛋白前A595×100

粗多糖損失率(%)=(脫蛋白(脫色)前多糖A490-脫蛋白(脫色)后A490)/脫蛋白(脫色)前A490

1.2.6 發芽糙米粗多糖層析純化三種填料的篩選 將溶脹好的凝膠DEAE-Sepharose 52取出后,加水與凝膠體積比例為1∶3,攪拌混勻凝膠后,35 ℃,30 kHz超聲10 min去除氣泡,濕法裝柱(Φ26 mm×300 mm),用水洗脫過夜[29]。將粗多糖樣品溶解在蒸餾水中,將其配為濃度為20 mg/mL多糖溶液,在20 ℃條件下用離心機8000 r/min離心10 min,取4 mL上清液上樣,流速換成5 mL/min,每管收集5 mL,用蒸餾水洗脫收集30管后,再用0.1、0.2、0.3 mol/L的NaCl分別進行梯度洗脫,每個梯度依次接收30管,用苯酚-硫酸跟蹤檢測含糖管A490,做出梯度洗脫曲線,對發芽糙米進行層析純化[30]。按照洗脫曲線收集各個主峰,Sephadax G50脫鹽柱進行脫鹽,采用旋轉蒸發儀,80 ℃,50 r/min,濃縮至1/3體積后真空冷凍、-60 ℃,12 h干燥備用。

相同實驗步驟操作DEAE-Sepharose Cl-6B、DEAE Fast Flow這兩種填料,通過洗脫曲線比較哪種填料的層析效果好。選擇實驗效果好的填料作為后續實驗柱層析的填料對發芽糙米進行層析純化。按照洗脫曲線收集各個主峰,Sephadax G50脫鹽柱進行脫鹽,濃縮后真空冷凍干燥(-60 ℃,12 h)備用。

1.2.7 發芽糙米多糖純度鑒定及其分子量的測定

1.2.7.1 紫外光譜分析 稱取適量經純化的各個組分多糖樣品,配制成濃度為1 mg/mL的溶液,把去離子水作為對比,在600～150 nm處做全波長掃描檢測[31]。

1.2.7.2 高效凝膠過濾色譜(HPGPC)測定分子量 準確稱量經柱層析分離純化后的發芽糙米水洗多糖和鹽洗多糖各 1 mg,溶于1 mL去離子水里,采用高效凝膠滲透色譜進行純度鑒定和分子量測定[32]。檢測條件[33]:GPC 色譜儀型號:LC-10A 型HPLC;檢測器:示差檢測器RID-10A;進樣器:自動進樣器 SIL-10AD;系統軟件:SHIMADZU CLASS-VP;色譜柱:UltrahydrogelTMLinear 7.8 mm×300 mm實驗條件:流動相:超純水;流速:0.5 mL/min;柱溫:40 ℃;柱操作壓力:1.6 MPa;樣品濃度:1 mg/mL;進樣量:20 μL。

1.3 數據處理

2 結果與分析

2.1 標準曲線的繪制

葡萄糖標準曲線的繪制:采用硫酸-苯酚法測定葡萄糖在波長490 nm處的吸光度值,縱坐標為吸光度值(y),葡萄糖濃度值(x)為橫坐標,得出葡萄糖標準曲線,結果如圖1所示。標準曲線線性回歸方程為y=0.129x-0.124,擬合系數R2=0.998,表明葡萄糖含量與吸光度值呈良好的線性關系(葡萄糖濃度0～0.05 mg/mL)。

圖1 葡萄糖標準曲線圖Fig.1 Glucose standard curve

牛血清蛋白標準曲線的繪制:采用考馬斯亮藍法測定葡萄糖在波長595 nm處的吸光度值,縱坐標為吸光度值(y),牛血清蛋白濃度值(x)為橫坐標,得出牛血清蛋白標準曲線,結果如圖2所示。標準曲線線性回歸方程為y=0.122x-0.117,擬合系數R2=0.998,表明牛血清蛋白含量與吸光度值呈良好的線性關系(牛血清蛋白濃度0～100 mg/mL)。

圖2 牛血清蛋白標準曲線Fig.2 The standard curve of bovine serum albumin

2.2 發芽糙米粗多糖脫蛋白工藝的研究

Sevage法和酶-Sevage法去除蛋白質的原理都是利用有機溶劑,使流離的蛋白變性成為不溶物,但粗多糖中含有糖蛋白,需要有機溶劑多次處理才能達到較好地去除蛋白的效果。由圖3、圖4可知,對發芽糙米粗多糖的脫蛋白處理次數越多,粗多糖的損失率越大,Sevage法經過4次處理后,盡管脫蛋白率已達到82.6%,但此時粗多糖已經損失過半,粗多糖得率較低,Sevage法反復處理次數較少時,脫蛋白效果不明顯,因此本試驗確定Seavge法對發芽糙米粗多糖溶液反復處理4次,此時粗多糖損失率為52%。酶-Sevage法經過2次處理后,蛋白脫除效果比較好,粗多糖損失也較少,采用此方法去除蛋白明顯,因此本試驗確定酶-Seavge法對發芽糙米粗多糖溶液處理2次。通過比較Seavge法(4次)、三氯乙酸法、酶-Sevage法(2次)三種脫蛋白方法,結果如圖5所示,三種方法去除蛋白效果明顯,粗多糖損失也明顯。三氯乙酸法與Sevage法蛋白脫除率分別為84.17%和81.28%,盡管兩種方法脫蛋白效率較好但粗多糖損失也較多,且Sevage法反復多次,操作麻煩且耗時,并耗費大量的有機試劑,不僅污染環境其成本也大。三氯乙酸法在酸性條件下與蛋白質作用同時,一定程度上通過酸水解作用也破壞了多糖的結構,不利于后續多糖結構分析和活性測定。酶Sevage法相對以上兩種脫蛋白方法，在保證脫蛋白率較高的情況下，粗多糖損失率較少。綜合評價脫蛋白效果與粗多糖損失,確定酶-Sevage法作為發芽糙米粗多糖的初步純化方法。

圖3 Sevage法脫蛋白Fig.3 Deproteinization with the Sevage method

圖4 酶-Sevage法脫蛋白Fig.4 Deproteinization with the enzyme-Sevage method

圖5 不同脫蛋白方法結果Fig.5 Results of different deproteining methods

2.3 發芽糙米多糖脫色工藝的研究

由圖6可知,活性炭吸附脫色法的脫色率為88.44%,但會造成很多的粗多糖損失,這是因為活性炭在脫色的同時也會吸附大量的粗多糖,且存在脫色后溶液中的炭殘渣難以完全去除的缺點。過氧化氫法脫色率較高,但由于過氧化氫是氧化性較強的氧化劑,過氧化氫氧化作用很有可能改變多糖的鏈狀結構,從而影響粗多糖的活性。AB-8大孔樹脂是弱極性樹脂,對弱極性的有機化合物具有較強的吸附能力,對極性大的多糖類物質吸附力弱。發芽糙米粗多糖溶液經AB-8大孔樹脂吸附色素后,脫色率為86.57%,粗多糖損失率為28.96%。三種脫色方法對粗多糖的脫色效果明顯,粗多糖損失也明顯。雖然脫色率比活性炭吸附法脫色率稍低,但粗多糖損失率相比大幅度降低,綜合比較大孔樹脂脫色效果較好。說明發芽糙米粗多糖中所含的色素物質極性與AB-8樹脂的極性相近,故脫色效果較佳。

圖6 不同脫色方法結果Fig.6 Results of different decoloring methods

由于大孔吸附樹脂法脫色具有操作簡便、條件溫和、脫色效果佳、色素可回收等優點,綜合考慮脫色效果與粗多糖損失兩者的效應,AB-8大孔樹脂吸附法是發芽糙米粗多糖最佳脫色方法。

2.4 柱層析填料的篩選

三種柱層析填料對發芽糙米粗多糖層析純化過柱洗脫曲線如圖7所示。

圖7 (A)DEAE-Cellulose 52,(B)DEAE Fast Flow,(C)DEAE Cl-6B洗脫曲線Fig.7 Stepwise elution curve of crude Polysaccharides on(A) DEAE-Cellulose 52,(B)DEAE Fast Flow,(C)DEAE Cl-6B chromatography column

由DEAE-Cellulose 52洗脫曲線可知,洗脫出三種多糖組分,第一個峰由蒸餾水洗脫得到,其含量為8.38%,經不同濃度的NaCl梯度洗脫,得到兩個峰,含量分別14.11%和4.25%,洗脫后的多糖組分和含量都相對較少,峰2無明顯的出峰時間間隔。且各個洗脫峰沒很好的分離開來，所以DEAE-Cellulose 52凝膠柱對糙米粗多糖的分離效果不好。因此不能選用此填料對糙米粗多糖進行分離純化。

由DEAE Fast Flow洗脫曲線可知,第一個峰型對稱并且很明顯,但其他的洗脫峰錯綜復雜,峰型不對稱,并且峰與峰之間無明顯的間隔,無法判斷洗脫下來幾種多糖組分,所以DEAE Fast Flow凝膠柱對發芽糙米粗多糖的分離效果不好。因此不能選用此填料對糙米粗多糖進行分離純化。

通過比較發現DEAE-Sepharose CL-6B層析柱對發芽糙米粗多糖的分離純化效果最好,多糖通過陰離子交換柱后因多糖所帶電荷性質不同,分離得到五個洗脫峰,峰型狹窄對稱,證明DEAE Sepharose CL-6B凝膠柱對發芽糙米粗多糖具有較好的分離效果。第一個峰由蒸餾水洗脫得到,其含量為32.82%,經不同濃度的NaCl梯度洗脫,得到四個峰,含量分別9.91%、8.15%、7.42%和1.92%,由于0.4 mol/L的NaCl洗脫下來的多糖含量較少,因此只收集含前三個主峰的試管中的洗脫液,對收集后的洗脫液減壓濃縮后,上Sephadex G50層析柱進行脫鹽,收集脫鹽后的各組分多糖真空冷凍干燥。

2.5 發芽糙米多糖純度鑒定及其分子量的測定

如圖8所示,根據紫外光分析可知,在吸光度在220、260和280 nm處都沒有明顯的峰值,說明不含有蛋白和核酸這兩種物質[19]。再采用高效凝膠滲透色譜檢測其相對分子量,線性回歸方程為:lg Mw=-0.1421tR+13.2451,式中:Mw為平均分子質量(kD);tR為保留時間(min);決定系數R2為0.9981。根據線性回歸方程計算結果如下:水洗多糖組分的平均分子量為1.47×105g/mol,鹽洗多糖組分的平均分子量為9.62×105、5.59×106和3.15×105Da。

圖8 水洗多糖組分紫外光譜Fig.8 The UV spectra of fraction from Polysaccharides in distilled water

3 結論

經2次酶-Sevage法脫蛋白效果較好且粗多糖損失率低,脫蛋白率為74.36%,粗多糖損失率為14.09%。大孔樹脂AB-8對發芽糙米粗多糖脫色效果最佳,脫色率為86.57%,粗多糖損失率為28.96%。對發芽糙米粗多糖進行柱層析的最佳填料為DEAE-Sepharose CL-6B。水洗多糖組分的平均分子量為1.47×105Da,鹽洗多糖組分的平均分子量分別為9.62×105、5.59×106、3.15×105Da。