碳氮比對(duì)真菌發(fā)酵桑枝燕麥麩皮的活性成分和抗氧化能力的影響

王 倩,張佳嬋,王昌濤,*,王守現(xiàn),趙 丹,王亞琳

(1.北京工商大學(xué)，北京食品營(yíng)養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心,北京 100048;2.北京市農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)環(huán)境保護(hù)研究所，北京市食用菌工程技術(shù)研究中心,北京 100097;3.云南白藥集團(tuán)股份有限公司,云南昆明 650504)

據(jù)《本草綱目》記載,桑枝味苦性平,有祛風(fēng)除濕、通經(jīng)活絡(luò)、化氣行水等功效。其含有多種活性成分,在降血糖、降血脂、抗氧化等方面擁有極高的應(yīng)用價(jià)值[1]。燕麥麩皮簡(jiǎn)單加工后就可富集25%的燕麥β-葡聚糖,燕麥β-葡聚糖是一種水溶性膳食纖維,在降血脂、降血糖及提高免疫力,維持腸道菌群平衡等方面表現(xiàn)優(yōu)異[2]。另外,其還可作為化妝品的有效成分,提高皮膚抗過(guò)敏能力,延緩皮膚衰老等。可廣泛用于食品、保健品、化妝品等行業(yè)。

藥食用真菌具有調(diào)節(jié)免疫、降血糖、降血壓、降膽固醇、抗腫瘤、抗氧化、抗病毒等多種保健功效[3-4]。其中韓芝(Ganodermalucidum)、猴頭菌(Hericiumerinaceus)、桑黃(Phellinusigniarius)以及奧德蘑(Oudemasiellapudensas)在保健品方面具有較高的開(kāi)發(fā)價(jià)值。研究表明:韓芝、猴頭菌、桑黃以及奧德蘑具有增強(qiáng)機(jī)體免疫能力、抗氧化方面、抗腫瘤作用等功能活性[5-11],在食品、醫(yī)藥、保健等領(lǐng)域受到廣泛關(guān)注。近年來(lái),已有不少研究以桑枝或燕麥麩皮為基質(zhì)栽培靈芝、猴頭菌,桑黃等藥食用真菌,但主要集中于開(kāi)發(fā)新的培養(yǎng)基質(zhì),并未對(duì)其混合菌質(zhì)的成分加以研究,并且對(duì)桑枝-燕麥麩皮聯(lián)合使用的研究也較少。

雙向固體發(fā)酵是以具備活性成分的物質(zhì)為發(fā)酵基質(zhì),以藥食用真菌為發(fā)酵菌種,定向控制所需發(fā)酵成分[12];而且基質(zhì)在為真菌提供生長(zhǎng)代謝所需營(yíng)養(yǎng)成分的同時(shí)在真菌產(chǎn)生的酶作用下,其成分得到有效的分解或轉(zhuǎn)化并與菌體及其代謝產(chǎn)物共同構(gòu)成具有不同功能的新型菌質(zhì),從而使發(fā)酵具有了雙向性,達(dá)到“1+1>2”的效果。本文以桑枝和燕麥麩皮為藥性基質(zhì),利用雙向固體發(fā)酵技術(shù),在四種不同的碳氮比條件下,發(fā)酵韓芝、猴頭菌、桑黃以及奧德蘑四種藥食用真菌,評(píng)價(jià)其生長(zhǎng)速度,并對(duì)最終得到的藥性菌質(zhì)進(jìn)行活性成分含量的測(cè)定和抗氧化功效的分析,為藥食用真菌在食品保健方面的開(kāi)發(fā)和利用提供一定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

韓芝、桑黃、猴頭菌、奧德蘑、桑枝、燕麥麩皮 均由北京市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院贈(zèng)送;蘆丁 中國(guó)藥品生物制品檢定所;無(wú)水葡萄糖、苯酚、濃硫酸、氫氧化鈉、鹽酸、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、鄰苯三酚、無(wú)水乙醇、30%雙氧水、1,1-二苯基苦基苯肼(DPPH)北京化工廠;硫酸銅、亞硝酸鈉、硝酸鋁、酒石酸鈉、焦性沒(méi)食子酸、鄰二氮菲、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、硫酸亞鐵、碳酸鈉 國(guó)藥化學(xué)試劑公司;聚乙烯袋 北京半夏科技發(fā)展有限公司。

TB-214電子分析天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司;JY3002電子天平 舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司;KQ-300E數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;3-18K高速自動(dòng)離心機(jī) 德國(guó)Sigma公司;HW·SY11-K電熱恒溫水浴鍋 北京市長(zhǎng)風(fēng)儀器儀表公司;UVmini-1240紫外分光光度計(jì) SHMADZU公司;SPX-250GB智能光照培養(yǎng)箱 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司;FW-80高速自動(dòng)粉碎機(jī) 西安儀創(chuàng)實(shí)驗(yàn)室儀器設(shè)備有限公司;DHG-9030A電熱恒溫干燥箱 北京精科華瑞有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 桑枝和燕麥麩皮的預(yù)處理 首先將桑枝按料水比1∶1.2 (g/g)加水進(jìn)行預(yù)濕2 d,每天手動(dòng)攪拌數(shù)次并覆蓋塑料膜,保證桑枝盡可能均勻吸水進(jìn)行預(yù)濕。按桑枝干料的2.2倍質(zhì)量稱取預(yù)濕后的桑枝,加入表1中相應(yīng)質(zhì)量的燕麥麩皮,最后加入燕麥麩皮干重1.2倍的水,用玻璃棒攪拌至均勻。

1.2.2 培養(yǎng)基的配制 碳氮比,是指有機(jī)物中總碳與總氮含量的比值,一般用“C/N”表示。根據(jù)青島科標(biāo)檢測(cè)研究院有限公司檢測(cè)數(shù)據(jù)知桑枝的碳含量為66%,氮含量為1%;燕麥麩皮的碳含量為43.96%氮含量為3.28%,通過(guò)計(jì)算得表1配料比。按照表1四種不同的碳氮比稱取培養(yǎng)基,裝入長(zhǎng)為15 cm×6 cm的聚乙烯袋中,每袋150 g,加入1.48 g的食用堿,121 ℃下滅菌40 min,備用。

表1 桑枝和燕麥麩皮配比表Table 1 Ingredients ratio of mulberry and oat bran

1.2.3 平均生長(zhǎng)速度的測(cè)定 培養(yǎng)基滅菌后每袋接入1 cm2斜面菌塊,放入培養(yǎng)箱中于28 ℃下,避光培養(yǎng)10～20 d,不同真菌生長(zhǎng)速度不同,直至菌絲長(zhǎng)滿培養(yǎng)基底部,發(fā)酵完全為止。每組設(shè)3個(gè)平行,濕度控制在60%左右。在菌絲開(kāi)始生長(zhǎng)處劃線記為生長(zhǎng)起點(diǎn),培養(yǎng)一段時(shí)間后在菌絲體延伸所在處再次劃線記為生長(zhǎng)終點(diǎn),測(cè)量菌絲的延伸長(zhǎng)度,以其延伸長(zhǎng)度記為生長(zhǎng)速度,計(jì)算平均生長(zhǎng)速度。

1.2.4 活性成分含量的測(cè)定 取1.2.3中的菌質(zhì)于烘箱中烘干,粉碎機(jī)粉碎后過(guò)80目網(wǎng)篩即為待測(cè)樣品,其中以未接種菌塊的培養(yǎng)基在培養(yǎng)箱中于28 ℃下,避光培養(yǎng)10～20 d后所得菌質(zhì)作為對(duì)照組。分別取2 g 樣品加入16 mL 去離子水或80%乙醇,25 ℃ 300 W下超聲提取1 h 后,在室溫下10000 r/min離心10 min,過(guò)濾后取其上清液即為水提液或醇提液,對(duì)二者進(jìn)行活性成分測(cè)定。

1.2.4.1 水提液中多糖含量的測(cè)定 采用苯酚-硫酸法[13]法測(cè)定發(fā)酵后體系的多糖含量,以無(wú)水葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),未發(fā)酵基質(zhì)水提液為空白對(duì)照,含量以mg/g干物質(zhì)表示;將待測(cè)樣品稀釋200倍后,取1 mL試樣于試管中,加入0.5 mL 5%苯酚溶液混勻,再加入2.5 mL濃硫酸充分混勻,5 min后封管沸水浴1 h,取出冷卻至室溫后在490 nm處測(cè)其吸光度值。以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo),得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:y=12.403x+0.0027,R2=0.9996。將樣品所得吸光度帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程中得到樣品濃度,按下式計(jì)算得出含量:含量=(樣品濃度×稀釋倍數(shù)×16)/2,1.2.4.2～1.2.4.4同。

1.2.4.2 水提液中多肽含量的測(cè)定 利用福林酚法[14]測(cè)定發(fā)酵前后體系多肽的含量,以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),未發(fā)酵基質(zhì)水提液為空白對(duì)照,含量以mg/g干物質(zhì)表示;將待測(cè)樣品稀釋20倍后,取1 mL試樣于試管中,加入5 mL試劑甲迅速混合在25 ℃下水浴10 min,逐管加入試劑乙混勻,25 ℃水浴反應(yīng)30 min后在700 nm處測(cè)吸光度。(試劑配制:試劑甲A:5 g Na2CO3+1 g NaOH+0.125 g酒石酸鉀鈉溶于500 mL去離子水;B:0.5 g硫酸銅溶于去離子水(50份A與1份B混合均勻。試劑乙:福林酚∶去離子水=1∶1)以牛血清蛋白濃度為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo),得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:y=0.5125x+0.1005,R2=0.9903。

1.2.4.3 醇提液中黃酮含量的測(cè)定 用硝酸鋁-亞硝酸鈉比色法[15]測(cè)定發(fā)酵前后體系的黃酮含量,以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),未發(fā)酵基質(zhì)醇提液為空白對(duì)照,含量以mg/g干物質(zhì)表示;取稀釋2.5倍后的待測(cè)樣品溶液2 mL于10 mL容量瓶中,加入3 mL 30%乙醇溶液,隨后加入5% NaNO2溶液0.3 mL,搖勻后靜置6 min,再加入0.3 mL 10% Al(NO3)3溶液,搖勻靜置6 min后加入4 mL 1 mol/L的NaOH溶液,加水定容至10 mL,搖勻放置15 min。在510 nm下測(cè)定吸光度。以蘆丁濃度為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo),得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:y=5.8x+0.032,R2=0.9996。

1.2.4.4 醇提液中多酚含量的測(cè)定 按福林酚法[16]測(cè)定發(fā)酵前后體系的多酚的含量,以沒(méi)食子酸為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),未發(fā)酵基質(zhì)醇提液為空白對(duì)照,含量以mg/g干物質(zhì)表示。取稀釋5倍后的待測(cè)樣品溶液1 mL于10 mL容量瓶中,然后依次加入1 mL蒸餾水,0.5 mL福林酚溶液,1.5 mL 26.7% Na2CO3溶液,去離子水定容至10 mL,搖勻。室溫下反應(yīng)2 h,760 nm處測(cè)定其吸光度。以沒(méi)食子酸濃度為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo),得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:y=1.473x-0.1074,R2=0.9909。

1.2.5 抗氧化能力測(cè)定 以1.2.4中得到的提取液對(duì)DPPH自由基和羥自由基的清除率作為其抗氧化能力的衡量標(biāo)準(zhǔn),清除率越高,抗氧化能力越強(qiáng)。以未發(fā)酵基質(zhì)的水提液與醇提液為空白對(duì)照,結(jié)果以百分比表示。

1.2.5.1 DPPH自由基清除能力測(cè)定 采用分光光度法[17]進(jìn)行測(cè)定,取1.5 mL待測(cè)液與1.5 mL 2×10-4mol/L的DPPH溶液混勻記為A1管;取1.5 mL待測(cè)物溶劑與1.5 mL 2×10-4mol/L的DPPH溶液混勻記為A2管;取1.5 mL待測(cè)物溶劑與1.5 mL待測(cè)液混勻記為A2管,反應(yīng)30 min后在517 nm處分別測(cè)定其吸光度。其清除率按下式計(jì)算。

清除率I(%)=(A2+A3-A1)×100/A2

不過(guò)筆者并不贊同過(guò)多地將“探究性”融入作文考察當(dāng)中，對(duì)照這六條標(biāo)準(zhǔn)，江蘇高考作文題在“探究性”方面是弱的。但其實(shí)反面想想，難道江蘇不正因如此，才成就了其獨(dú)特的“個(gè)性”嗎？江蘇高考語(yǔ)文一向提倡與贊揚(yáng)記敘文文體，希望在高考作文中挖掘出優(yōu)秀的記敘文，而因?yàn)樵诿}中“探究性”與“思辨色彩”的相對(duì)不強(qiáng)，才給了記敘文書(shū)寫一定的“喘息空間”。如果作文材料思辨色彩過(guò)于濃厚，連命題人都想讓學(xué)生去寫議論文了，學(xué)生哪還能寫出優(yōu)秀的記敘文來(lái)呢？

1.2.5.2 羥自由基清除能力測(cè)定 羥自由基清除率則是采用鐵氧化鄰二氮菲法[18]進(jìn)行測(cè)定。取0.5 mL 0.75 mmol/L鄰二氮菲于試管中,1 mL 0.15 mol/L 磷酸鹽緩沖液(pH=7.4),0.5 mL蒸餾水,充分混合。加入0.5 mL 0.75 mmol/L硫酸亞鐵溶液,混勻后加0.5 mL 0.01%雙氧水,于37 ℃水浴60 min,在536 nm測(cè)吸光度,所得數(shù)值為損傷吸光度A1。以0.5 mL水替代損傷管中0.01% H2O2,操作同損傷管,得到未損傷吸光度A2,樣品管以0.5 mL樣品液代替0.01% H2O2,操作同損傷管,得到樣品管吸光度A3。清除率計(jì)算如下:清除率(%)=(A3-A1)×100/(A2-A1)

2 結(jié)果與分析

2.1 碳氮比對(duì)菌絲生長(zhǎng)速度的影響

碳氮比是藥食真菌生長(zhǎng)的重要因素。真菌菌絲的生長(zhǎng)經(jīng)歷的延滯期、迅速生長(zhǎng)期和衰退期三個(gè)階段[19],不同階段的生長(zhǎng)速度不同,對(duì)碳氮比的要求不同。圖1為四種藥食用真菌菌絲在四種不同碳氮比下的生長(zhǎng)狀態(tài)。經(jīng)測(cè)定和統(tǒng)計(jì)得到表2。從表2可以看出,不同的菌種對(duì)碳氮比的要求不同。隨著碳氮比的增大,韓芝菌絲體潔白濃密度相當(dāng),平均生長(zhǎng)速度無(wú)顯著變化(p>0.05),但整體生長(zhǎng)速度普遍高于其他三種真菌(p<0.05);猴頭菌生長(zhǎng)速度隨碳氮比的增大呈上升趨勢(shì),在碳氮比為50∶1 (g/g)時(shí),平均生長(zhǎng)速度高達(dá)(2.75±0.24) mm(p<0.05),但是菌絲生長(zhǎng)的潔白濃密度略低于其它碳氮比;桑黃在碳氮比為20∶1 (g/g)時(shí)生長(zhǎng)速度顯著低于其他碳氮比,且碳氮比30∶1～50∶1 (g/g)時(shí)生長(zhǎng)速度無(wú)顯著差異;奧德蘑在考察碳氮比范圍內(nèi)生長(zhǎng)速度無(wú)顯著性差異。

表2 碳氮比對(duì)四種真菌菌絲生長(zhǎng)速度的影響Table 2 Effects of C/N ratio on mycelial growth rates of four edible fungi

圖1 碳氮比對(duì)四種藥食用真菌(韓芝A,猴頭菌B,桑黃C,奧德蘑D)菌絲生長(zhǎng)速度的影響Fig.1 Effects of C/N ratio on mycelial growth rate of four edible fungi(Ganoderma lucidum A,Hericium erinaceus B,Phellinus igniarius C,Oudemasiella radiate D)注:A、B、C、D每個(gè)圖中的碳氮比從左到右依次為20∶1、30∶1、40∶1、50∶1 g/g。

菌絲的生長(zhǎng)是靠菌絲尖端的生長(zhǎng)點(diǎn)及其自身分解的基物酶,將大分子的物質(zhì)分解成小分子的物質(zhì)進(jìn)入體內(nèi)的。本次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),高碳氮比時(shí),四種菌種的生長(zhǎng)速度較快,有利于大分子物質(zhì)分解進(jìn)入體內(nèi)。而宋愛(ài)榮等[20]證明較高的氮含量對(duì)菌絲的生長(zhǎng)有益,該結(jié)論與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果不符。這可能與桑枝的特殊活性成分有關(guān),鄒湘月[21]等研究發(fā)現(xiàn)在液態(tài)培養(yǎng)基中添加桑枝水提物對(duì)桑黃生物量的增長(zhǎng)有顯著促進(jìn)作用。說(shuō)明菌絲體的生長(zhǎng)應(yīng)為多種物質(zhì)共同作用的結(jié)果。

2.2 碳氮比對(duì)發(fā)酵菌質(zhì)活性成分含量的影響

2.2.1 碳氮比對(duì)發(fā)酵菌質(zhì)多糖含量的影響 碳氮比對(duì)發(fā)酵菌質(zhì)多糖含量的影響見(jiàn)圖2,從圖2中可以看出,對(duì)照組多糖含量隨碳氮比的增加而減小,這與基質(zhì)中燕麥麩皮比例的降低有關(guān);大部分實(shí)驗(yàn)組多糖含量高于相應(yīng)對(duì)照組,是因?yàn)槲⑸锞z體也富含多糖類物質(zhì),微生物生長(zhǎng)將大分子淀粉類物質(zhì)分解成小分子多糖,并逐漸轉(zhuǎn)化為自身營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),從而使多糖更易被提取和檢測(cè)[22]。并且,隨著碳氮比的增加,四種真菌發(fā)酵后多糖的含量均有降低趨勢(shì)但高于對(duì)照組。

圖2 碳氮比對(duì)四種藥食用真菌多糖含量的影響Fig.2 Effects of C/N ratio on polysaccharide contents of four edible fungi

除韓芝外,猴頭菌、桑黃和奧德蘑菌質(zhì)隨著碳氮比的增加,其水提液中多糖含量呈下降趨勢(shì)。韓芝在碳氮比為20∶1～40∶1 (g/g)呈下降趨勢(shì),在碳氮比為50∶1 (g/g)時(shí)多糖含量稍有上升,可能為在此碳氮比下基質(zhì)中多糖已滿足其菌絲體生長(zhǎng)所需營(yíng)養(yǎng),自身生命代謝活動(dòng)導(dǎo)致多糖含量增加;四種真菌在碳氮比為20∶1 (g/g)時(shí),多糖含量最高,其中桑黃和奧德蘑最高可分別達(dá)到(132.80±1.16)和(111.22±4.83) mg/g干物質(zhì),約為發(fā)酵前水平的2倍,這與秦俊哲等[23]利用中藥渣為培養(yǎng)基培養(yǎng)靈芝得到的靈芝菌絲中多糖和氨基酸含量均比子實(shí)體提高2倍以上的結(jié)論相似。這是因?yàn)?隨著碳氮比的增大,微生物因生長(zhǎng)而分解基質(zhì)中的糖類物質(zhì),從而使多糖含量降低,此推論符合表2所得結(jié)果:隨著碳氮比的增加,微生物生長(zhǎng)速度呈上升趨勢(shì)。

2.2.2 碳氮比對(duì)發(fā)酵菌質(zhì)多肽含量的影響 碳氮比對(duì)發(fā)酵菌質(zhì)多肽含量的影響見(jiàn)圖3,隨碳氮比的增加,韓芝菌質(zhì)水提液中的多肽含量始終高于對(duì)照組,隨著碳氮比的增加,多肽含量呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢(shì),碳氮比為30∶1 (g/g)和40∶1 (g/g)時(shí)多肽含量較低;說(shuō)明此碳氮比下韓芝將菌質(zhì)中的多肽分解轉(zhuǎn)化為小分子氮源,以滿足自身生長(zhǎng)需要,這也符合表2中韓芝在碳氮比為30∶1 (g/g)和40∶1 (g/g)時(shí)生長(zhǎng)較快的結(jié)論。

圖3 碳氮比對(duì)四種藥食用真菌多肽含量的影響Fig.3 Effects of C/N ratio on polypeptide contents of four edible fungi

猴頭菌、桑黃和奧德蘑菌質(zhì)多肽含量隨碳氮比的增加而均呈下降趨勢(shì),分別由(92.57±5.55)、(133.15±4.24)、(127.84±3.42) mg/g干物質(zhì),降低至(21.07±1.41)、(29.50±1.26)和(21.07±1.30) mg/g干物質(zhì);并且在較低碳氮比時(shí),三種真菌的多肽含量高于對(duì)照組水平,其中在碳氮比為20∶1 (g/g)時(shí),桑黃和奧德蘑多肽含量遠(yuǎn)高于對(duì)照組,隨碳氮比的增長(zhǎng)多肽含量逐漸低于對(duì)照組,可能是碳氮比增大,菌絲體大量生長(zhǎng),分解代謝氨基酸產(chǎn)生乙酰輔酶A,參與三羧酸循環(huán),而氮元素含量較低,真菌維持自身生長(zhǎng)所需多肽含量大于自身代謝所合成多肽量,使總體多肽含量降低。郭霞[24]在對(duì)桑黃的發(fā)酵過(guò)程中也發(fā)現(xiàn)氮源被大量利用參與菌絲和胞外多糖的合成,本實(shí)驗(yàn)結(jié)論與其相符。

2.2.3 碳氮比對(duì)發(fā)酵菌質(zhì)黃酮含量的影響 碳氮比對(duì)發(fā)酵菌質(zhì)黃酮含量的影響見(jiàn)圖4,從圖4中可知,韓芝在碳氮比為30∶1～50∶1 (g/g)時(shí),黃酮含量高于對(duì)照組;猴頭菌在碳氮比在20∶1～40∶1 (g/g)時(shí)黃酮含量高于對(duì)照組,且隨碳氮比的增長(zhǎng)逐漸降低;桑黃黃酮含量在碳氮比為30∶1 (g/g)時(shí)最高達(dá)(1.34±0.01) mg/g干物質(zhì);奧德蘑黃酮含量則隨碳氮比的增加整體呈下降趨勢(shì),由(1.86±0.08) mg/g干物質(zhì)下降至(0.66±0.01) mg/g干物質(zhì),下降了約2/3。

圖4 碳氮比對(duì)四種藥食用真菌黃酮含量的影響Fig.4 Effects of C/N ratio on flavonoids contents of four edible fungi

2.2.4 碳氮比對(duì)發(fā)酵菌質(zhì)多酚含量的影響 碳氮比對(duì)發(fā)酵菌質(zhì)多酚含量的影響見(jiàn)圖5。從圖5中可知,在碳氮比大于20∶1 (g/g)時(shí),除韓芝外,其它三種真菌多酚含量均低于對(duì)照組;韓芝菌質(zhì)多酚含量隨碳氮比的增長(zhǎng)總體呈先下降后增長(zhǎng)趨勢(shì),在碳氮比為30∶1 (g/g)時(shí)達(dá)到最低,為(12.85±0.56) mg/g干物質(zhì);猴頭菌與桑黃多酚含量趨勢(shì)均為先下降后趨于平緩,奧德蘑多酚含量隨碳氮比的增加先增長(zhǎng)后下降最終趨于平緩,在碳氮比為30∶1 (g/g)時(shí)含量達(dá)到最高;與對(duì)照組相比猴頭菌、桑黃和奧德蘑在碳氮比為50∶1 (g/g)時(shí),多酚濃度在發(fā)酵后分別下降了(6.57±0.18)、(6.78±0.25)和(5.64±0.47) mg/g干物質(zhì),下降了約1/3。

圖5 碳氮比對(duì)四種藥食用真菌多酚含量的影響Fig.5 Effects of C/N ratio on polyphenols contents of four edible fungi

發(fā)酵菌質(zhì)多酚含量低于對(duì)照組的原因,可能在破壁過(guò)程中木質(zhì)素等大分子酚類物質(zhì)在多種酶的作用下被轉(zhuǎn)化利用合成了其它物質(zhì),因分解速率高于合成速率而呈現(xiàn)降低狀態(tài)。此外,真菌在發(fā)酵過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生自由基,自由基隨真菌代謝大量積累,可能使多酚含量降低。Nitayapat等[28]在使用香菇類真菌發(fā)酵橘子渣時(shí)也發(fā)現(xiàn)多酚含量急劇下降。魏龍[29]在靈芝-當(dāng)歸雙向發(fā)酵過(guò)程中發(fā)現(xiàn),在發(fā)酵后的菌質(zhì)中新檢測(cè)出了9種化合物;此外發(fā)酵后有8種物質(zhì)含量明顯升高、8種物質(zhì)含量明顯降低,表明發(fā)酵基質(zhì)在真菌的多種酶作用下進(jìn)行了復(fù)雜的分解、轉(zhuǎn)化與合成。敢小雙[26]也表示靈芝在生長(zhǎng)過(guò)程中代謝掉了原來(lái)的一些物質(zhì),使其含量減少或消失。

2.3 碳氮比對(duì)發(fā)酵菌質(zhì)抗氧化活性的影響

2.3.1 碳氮比對(duì)發(fā)酵菌質(zhì)DPPH清除率的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:發(fā)酵后水提液對(duì)于DPPH自由基幾乎無(wú)清除能力。而發(fā)酵后醇提液與空白對(duì)照相比均有較好的清除能力,韓芝的自由基清除能力隨碳氮比的增大先增強(qiáng)后減弱,在碳氮比為40∶1 (g/g)的時(shí)候達(dá)到了最大,最高清除率達(dá)到96.9%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與魏龍[29]發(fā)現(xiàn)靈芝當(dāng)歸雙向發(fā)酵中,隨著當(dāng)歸添加量的增加,發(fā)酵菌質(zhì)的DPPH自由基清除能力均呈先上升后下降趨勢(shì)的結(jié)果相似,說(shuō)明韓芝的DPPH自由基清除率變化與發(fā)酵基質(zhì)變化有很大關(guān)系。其它三種真菌發(fā)酵后的DPPH自由基清除能力均高于空白對(duì)照,并且隨碳氮比的增長(zhǎng)變化不大。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在發(fā)酵過(guò)程中,真菌代謝產(chǎn)生的酶將桑枝-燕麥麩皮中的有效成分充分的釋放出來(lái),并且自身產(chǎn)生了活性物質(zhì),使其抗氧化能力大大的上升。

圖6 碳氮比對(duì)四種藥食用真菌發(fā)酵后醇提液的DPPH自由基清除率的影響Fig.6 Effects of C/N ratio on DPPH· scavenging rate of origin and fermented ethanol extract of four edible fungi

2.3.2 碳氮比對(duì)發(fā)酵菌質(zhì)羥自由基清除率的影響 在水提液(圖7)碳氮比小于30∶1 (g/g)時(shí),四種真菌發(fā)酵后羥自由基清除能力相比于對(duì)照組均有提升,說(shuō)明真菌水提液具有一定的抗氧化能力。高開(kāi)顯[30]研究了靈芝發(fā)酵桑枝苦參的功效及成分變化,結(jié)果顯示苦參經(jīng)靈芝發(fā)酵后,其水提取物清除羥自由基能力顯著提高;而碳氮比大于30∶1 (g/g)后,除韓芝外,其它三種真菌發(fā)酵后羥自由基清除能力均低于對(duì)照組,隨碳氮比的增加,基質(zhì)中燕麥麩皮含量減小,而發(fā)酵后菌質(zhì)自由基清除能力也在減小;可能碳氮比較大時(shí),真菌通過(guò)代謝將多糖和多肽轉(zhuǎn)化成了其他物質(zhì),從而使得水提液的抗氧化能力減弱。

圖7 碳氮比對(duì)四種藥食用真菌發(fā)酵后水提液的羥自由基清除率的影響Fig.7 Effects of C/N ratio on hydroxyl radical scavenging rate of fermented water extracting solution of four edible fungi

對(duì)于醇提液(圖8),韓芝發(fā)酵后羥自由基清除能力隨碳氮比的增大而增大,猴頭菌則先增大后減小,桑黃先減小后增大,而奧德蘑則呈不斷減小趨勢(shì)。醇提液羥自由基清除結(jié)果基本符合黃酮的變化趨勢(shì),推測(cè)醇提液中對(duì)羥自由基有清除能力的活性物質(zhì)為黃酮[31]。

圖8 碳氮比對(duì)四種藥食用真菌發(fā)酵后醇提液的羥自由基清除率的影響Fig.8 Effects of C/N ratio on hydroxyl radical scavenging rate of fermented ethanol extracting solution of four edible fungi

3 討論與結(jié)論

隨碳氮比的增加,韓芝、奧德蘑菌絲體生長(zhǎng)速度未見(jiàn)顯著變化,猴頭菌與桑黃菌絲體生長(zhǎng)速度明顯增長(zhǎng)(p<0.05)。發(fā)酵后混合菌質(zhì)活性成分含量明顯變化,當(dāng)碳氮比為20∶1 (g/g)時(shí),桑黃和奧德蘑多糖含量最高達(dá)到(132.8±1.16)和(111.22±4.83) mg/g干物質(zhì),多肽含量明顯增加,桑黃和奧德蘑多肽含量增加了一倍多;黃酮含量也有明顯增長(zhǎng)。而多酚整體含量下降,在碳氮比為50∶1 (g/g)時(shí),猴頭菌、桑黃和奧德蘑的多酚含量在發(fā)酵后下降了約1/3。不同的碳源[32]與氮源[33]對(duì)不同的菌絲體生長(zhǎng)與代謝的影響有明顯差異。例如乳糖最適合靈芝菌體的生長(zhǎng)、胞內(nèi)多糖及靈芝酸的合成,而蔗糖則最有利于靈芝胞外多糖的合成[34]。藥食用真菌生長(zhǎng)發(fā)育不同階段所需碳氮比不同。一般較低的碳濃度有利于菌絲體生長(zhǎng),促進(jìn)碳源向菌絲體轉(zhuǎn)化,反之則有利于底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物。Park等[35]發(fā)現(xiàn)碳氮比不僅影響許多生物代謝合成速率,對(duì)真菌菌絲體生長(zhǎng)和胞外聚合物產(chǎn)量也有影響,并通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明較高的碳氮比對(duì)菌絲體生長(zhǎng)和胞外聚合物生產(chǎn)有益。Babitskaia等[36]也發(fā)現(xiàn)當(dāng)碳氮比為18∶1 (g/g)時(shí),最適宜靈芝胞內(nèi)多糖的合成,而碳氮比為25∶1 (g/g)時(shí),胞外多糖產(chǎn)量最高。

目前公認(rèn)通過(guò)真菌發(fā)酵可以提升發(fā)酵底物的抗氧化性,Divate[37]發(fā)現(xiàn)烏靈參的抗氧化活性受到發(fā)酵底物的顯著影響,并且不同的底物可能具有不同的抗氧化機(jī)制。高濃度的酚類和類黃酮化合物可能有助于烏靈參的抗氧化活性。Liu等[38]研究通過(guò)發(fā)酵技術(shù),說(shuō)明了游離酚和肽的變化對(duì)脫脂小麥胚芽總抗氧化性能的協(xié)同作用。謝麗源等[39]對(duì)23株不同靈芝菌株的主要活性物質(zhì)多糖、多酚、黃酮、三萜含量進(jìn)行測(cè)定,研究表明四種活性物質(zhì)含量與各抗氧化測(cè)定方法間相關(guān)系數(shù)低,證明靈芝的抗氧化能力貢獻(xiàn)并不完全來(lái)自這四類物質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)中發(fā)酵菌質(zhì)醇提液對(duì)DPPH自由基有較強(qiáng)的清除能力,在碳氮比為40∶1 (g/g)時(shí),韓芝DPPH自由基清除率最高達(dá)到96.9%;四種真菌對(duì)于羥自由基的清除也有較明顯的提升。本文中不同碳氮比的發(fā)酵基質(zhì)下,同一菌種發(fā)酵后菌質(zhì)的抗氧化能力不同;相同碳氮比發(fā)酵基質(zhì)下不同菌種發(fā)酵后菌質(zhì)的抗氧化能力也有明顯差異。綜合推測(cè),發(fā)酵后菌質(zhì)的抗氧化能力受多方面因素的影響,包括發(fā)酵基質(zhì)、發(fā)酵菌種以及發(fā)酵條件等。就活性物質(zhì)而言,雖然發(fā)酵后菌質(zhì)多酚含量明顯下降,但其DPPH自由基和羥自由基清除能力明顯上升,判斷發(fā)酵后菌質(zhì)主要依靠為多糖、多肽以及黃酮等多種物質(zhì)協(xié)同作用達(dá)到抗氧化效果。