西藏曲拉和發(fā)酵乳中抗氧化和益生特性乳酸菌的篩選及鑒定

劉亞?wèn)|,張 悅,賀銀鳳,李 暢,吳 榮,賀 敏,李 博

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,內(nèi)蒙古呼和浩特 010018;2.內(nèi)蒙古包頭市疾病預(yù)防控制中心,內(nèi)蒙古包頭 014030;3.內(nèi)蒙古伊利實(shí)業(yè)集團(tuán)股份有限公司,內(nèi)蒙古呼和浩特 010018)

西藏地區(qū)高海拔、相對(duì)獨(dú)立的生態(tài)環(huán)境致使其傳統(tǒng)牦牛乳制品曲拉和發(fā)酵乳具有獨(dú)特且豐富的乳酸菌[1-2]。曲拉(藏語(yǔ),指奶渣)是藏區(qū)牧民以脫脂牦牛乳為原料,添加自然條件下儲(chǔ)存的含有大量乳酸菌的乳清為發(fā)酵引子,經(jīng)發(fā)酵、脫水、后熟、干制而成的民族傳統(tǒng)乳制品;除供食用外,也常用作發(fā)酵乳的引子[3]。

近年來(lái),西藏地區(qū)傳統(tǒng)牦牛乳制品中乳酸菌的抗氧化應(yīng)激特性是研究的重要方向。氧化應(yīng)激(Oxidative Stress)及其導(dǎo)致的氧化損傷現(xiàn)象,已成為備受關(guān)注的機(jī)體病變重要原因之一[4]。機(jī)體抗氧化系統(tǒng)的內(nèi)源性調(diào)節(jié)僅能在一定范圍內(nèi)清除導(dǎo)致氧化應(yīng)激現(xiàn)象的自由基(Free Radical)、活性氮(RNS,Reactive Nitrogen Species)等[5],因此,補(bǔ)充外源性抗氧化劑緩解氧化應(yīng)激狀態(tài)[6]具有重要意義。目前,雖然針對(duì)藏區(qū)傳統(tǒng)牦牛乳制品中抗氧化乳酸菌的研究已有較多的報(bào)道,但是大多集中于抗氧化應(yīng)激特性的篩選和機(jī)制研究[7-9],對(duì)于兼具益生特性菌株的開(kāi)發(fā)存在不足。

乳酸菌進(jìn)入人體后能否耐受胃酸和膽鹽的逆環(huán)境脅迫,是其發(fā)揮抗氧化作用的重要前提條件。因此,本實(shí)驗(yàn)通過(guò)溶鈣圈法對(duì)采集自西藏牧區(qū)的9份曲拉和發(fā)酵乳中的乳酸菌進(jìn)行了抗氧化應(yīng)激和益生特性乳酸菌的分離、篩選和鑒定。以期為天然抗氧化劑的開(kāi)發(fā)提供優(yōu)良菌株,豐富西藏地區(qū)乳酸菌資源庫(kù)的開(kāi)發(fā)與利用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

9份西藏牧區(qū)自然發(fā)酵牦牛乳制品信息見(jiàn)表1;標(biāo)準(zhǔn)菌株糞腸球菌CICC 10396(Enterococcusfaecalis) 中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(CICC);MRS液體培養(yǎng)基(MRS固體和半固體培養(yǎng)基在MRS液體培養(yǎng)基基礎(chǔ)上分別添加1.5%、0.75%的瓊脂) 廣東環(huán)凱生物科技有限公司;瓊脂糖、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH·) 美國(guó)Sigma公司;PrimeSTAR HS DNA Polymerase、DL2000 DNA Marker、6×Loading buffer、核酸染料 日本TaKaRa公司;細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒 天根生化科技有限公司;2×Easy Taq Super Mix 北京全式金生物有限公司;溶菌酶-306A046 北京索萊寶科技有限公司;其他藥品 均為國(guó)產(chǎn)分析純。

表1 樣品信息Table 1 Sample information

Thermo Scientific Multiskan FC酶標(biāo)儀 美國(guó)Thermo Fisher公司;UV-1800紫外分光光度計(jì) 上海美譜達(dá)儀器有限公司;JY88-IIN超聲波破碎儀 寧波新芝生物科技股份有限公司;5810R離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf有限公司;電泳儀 美國(guó)Bio-Rad公司;Veriti 96孔PCR儀 美國(guó)Applied Biosystems公司;GelDocXR+凝膠成像儀 美國(guó)Bio-Rad公司;OptionS7+ClassicUVF超純水系統(tǒng) 英國(guó)ELGA公司;BILON-08無(wú)菌均質(zhì)器 上海比朗儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 乳酸菌的分離純化與保存 樣品的處理:稱取5 g切成小塊的曲拉(發(fā)酵乳吸取5 mL)加入裝有45 mL生理鹽水的均質(zhì)袋中,均質(zhì)5 min(拍擊速度:6次/秒)得到樣品懸濁液;富集:吸取2 mL樣品懸濁液加入18 mL的脫脂乳中分別置于30 ℃和37 ℃進(jìn)行樣品懸濁液的第一次厭氧富集(5 d),利用MRS液體培養(yǎng)基,按照上述培養(yǎng)條件進(jìn)行第二次富集;分離與純化:挑取第二次富集液劃線于含7.5‰ CaCO3的MRS固體培養(yǎng)基(30 ℃/37 ℃,厭氧5 d),培養(yǎng)24 h挑取具有透明溶鈣圈的菌落進(jìn)行革蘭氏染色觀察和MRS半固體穿刺保存,將革蘭氏陽(yáng)性的菌株繼續(xù)劃線培養(yǎng),直至得到純培養(yǎng)物,并進(jìn)行過(guò)氧化氫酶試驗(yàn),記錄特征形態(tài)、采集圖像;保存:將具有溶鈣圈、革蘭氏陽(yáng)性和過(guò)氧化氫酶陰性[10]的菌株進(jìn)行甘油和真空冷凍干燥保存。

1.2.2 抗過(guò)氧化氫菌株的篩選 利用平板擴(kuò)散法初篩具有抗氧化能力的試驗(yàn)菌株,在培養(yǎng)皿中加入10 mL MRS固體培養(yǎng)基,靜置冷卻;加入20 mL混有2%三代試驗(yàn)菌株培養(yǎng)液的MRS固體培養(yǎng)基,搖勻,冷卻;加入10 mL含0.3%過(guò)氧化氫的1.5%瓊脂水溶液[11]。將上述試驗(yàn)菌株的培養(yǎng)皿于其分離溫度(30 ℃或37 ℃)下倒置培養(yǎng)2 d,選取形成單菌落的高抗菌株進(jìn)行后續(xù)研究。

1.2.3 抗過(guò)氧化氫菌株清除自由基能力的篩選 取10 mL三代試驗(yàn)菌株培養(yǎng)液，利用同體積無(wú)菌超純水離心(4 ℃,4000 r/min,6 min)洗滌兩次后,重懸成菌懸液,吸取5 mL菌懸液利用超聲波破碎儀(280 w,2 s/2 s,20 min)冰浴破碎處理,經(jīng)顯微鏡檢查無(wú)完整細(xì)胞后離心(4 ℃,12000 r/min,10 min)取上清液,即為無(wú)細(xì)胞提取物。清除DPPH·的試驗(yàn)方法參考文獻(xiàn)[12],清除羥自由基(·OH)試驗(yàn)方法參考文獻(xiàn)[13];其中用400 mg/mL的維生素C溶液、超純水替代樣品,分別為陽(yáng)性對(duì)照組和空白對(duì)照組。

1.2.4 基于16S rRNA基因片段分析鑒定抗氧化菌株 試驗(yàn)菌株和標(biāo)準(zhǔn)菌株DNA的提取參考細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)中步驟,進(jìn)行總DNA的提取;參考文獻(xiàn)[14]中方法進(jìn)行16S rRNA片段擴(kuò)增,取5 μL擴(kuò)增后的產(chǎn)物,用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),若1500 bp處有清晰的擴(kuò)增條帶,無(wú)非特異性產(chǎn)物,表明PCR擴(kuò)增成功;委托上海英濰捷基貿(mào)易有限公司對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序,測(cè)序結(jié)果利用DNAStar軟件中的SeqMan雙向拼接后,在GeneBank中利用BLAST進(jìn)行同源性序列檢索,選擇Mega7.0中的鄰接法(Neighbor-Joining)將同源性較高的菌株序列連同試驗(yàn)菌株序列進(jìn)行1000次自展(Bootstrap)檢驗(yàn)后,繪制系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.2.5 抗氧化菌株對(duì)酸、膽鹽的耐受性評(píng)價(jià) 初始pH對(duì)乳酸菌生長(zhǎng)的影響:將三代試驗(yàn)菌株以體積分?jǐn)?shù)為1%的接種量,加至pH為1、2、3、4、5、6、7、8、9的MRS液體培養(yǎng)基中,于37 ℃培養(yǎng)18 h,用酶標(biāo)儀測(cè)定595 nm下的OD值[15]。模擬胃液pH對(duì)乳酸菌存活的影響:吸取1 mL三代試驗(yàn)菌液于9 mL pH3、0.2% NaCl的溶液中,靜置處理2 h,并于0、2 h對(duì)試驗(yàn)菌株進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)[16];利用如下公式進(jìn)行存活率Sr的計(jì)算,式中a為未經(jīng)酸處理的試驗(yàn)菌株活菌數(shù)/CFU·mL-1,b為經(jīng)酸處理2 h的試驗(yàn)菌株活菌數(shù)/CFU·mL-1。

乳酸菌對(duì)膽鹽的耐受性:將三代試驗(yàn)菌株以體積分?jǐn)?shù)為1%的接種量,加入含有0、0.3%膽鹽(人體進(jìn)食后腸道中膽鹽平均濃度[17])的MRS液體培養(yǎng)基中,于37 ℃培養(yǎng),每2 h用酶標(biāo)儀測(cè)定595 nm下的OD值,以O(shè)D值變動(dòng)0.3為1單位,對(duì)比與未加膽鹽組的滯后生長(zhǎng)時(shí)間[18]。

1.3 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 抗過(guò)氧化氫菌株的分離和初步鑒定結(jié)果

過(guò)氧化氫是一種強(qiáng)氧化物,菌株對(duì)其耐受能力與抗氧化能力呈現(xiàn)一定的正相關(guān)性[19]。利用溶鈣圈法從采自西藏林芝和山南牧區(qū)的9份樣品(曲拉、發(fā)酵乳)中分得62株菌株,其中23株對(duì)0.30%過(guò)氧化氫具有耐受能力。由表2可知,23株抗過(guò)氧化氫菌株菌落形態(tài)大多表現(xiàn)為直徑0.5～2 mm、白色、圓形、突起或微隆起、不透明或半透明、邊緣整齊;革蘭氏染色無(wú)芽孢、均為陽(yáng)性,其中10株桿菌、13株球菌;過(guò)氧化氫酶陰性且溶鈣圈為陽(yáng)性,具備一定的產(chǎn)酸能力,符合乳酸菌的特征[10]。

表2 抗過(guò)氧化氫菌株的編號(hào)、形態(tài)和初步鑒定結(jié)果Table 2 Results of number,morphology and preliminary identification of hydrogen peroxide resistant strain

2.2 菌株清除自由基能力的篩選結(jié)果

DPPH·是一種穩(wěn)定的人工合成有機(jī)自由基,可通過(guò)測(cè)定OD517值的變化定量的評(píng)價(jià)抗氧化劑清除該自由基的能力[20];而·OH具備很強(qiáng)的氧化性,在其脅迫下可損傷生物細(xì)胞的大分子,影響正常生理功能[21],評(píng)價(jià)這兩種自由基的清除率是篩選抗氧化菌株的一種穩(wěn)定且操作簡(jiǎn)單的方法。

由表3可知,23株菌株對(duì)兩種自由基都具有不同程度的清除能力,23株菌懸液清除DPPH·的能力顯著高于無(wú)細(xì)胞提取物(p<0.05),而18株無(wú)細(xì)胞提取物對(duì)·OH的清除能力顯著高于菌懸液(p<0.05),且同一株菌株對(duì)DPPH·和·OH的清除能力間不存在對(duì)應(yīng)關(guān)系;其中菌株5-D、9-E、5-E、4-C對(duì)DPPH·具備最顯著清除能力(p<0.05),菌株4-C、5-E、1-B、1-E清除·OH的能力最顯著(p<0.05),具備較高的抗氧化能力。具體表現(xiàn)為,由表3中DPPH·清除率可知,23株菌株的菌懸液對(duì)DPPH·的清除能力均顯著高于(p<0.05)無(wú)細(xì)胞提取物,如清除率最高的5-D、9-E菌懸液清除率分別為86.97%±0.11%、53.63%±0.19%,然而對(duì)應(yīng)的無(wú)細(xì)胞提取物清除率卻僅為19.52%±0.11%、1.18%±0.04%;由表3中·OH清除率可知,除菌株2-D、5-C、5-D、5-K、9-G外,其余18株菌株的無(wú)細(xì)胞提取物對(duì)·OH的清除能力均顯著(p<0.05)高于菌懸液,如4-C、5-E的無(wú)細(xì)胞提取物清除率為27.62%±0.28%、17.80%±0.09%,而菌懸液清除率僅為8.54%±0.07%、2.9%±0.06%;對(duì)比表3發(fā)現(xiàn),對(duì)DPPH·清除率最高的5-D,然而·OH清除率僅為1.80%±0.06%,·OH清除率較高的1-B、1-E,DPPH·清除率僅為15.94%±0.07%和23.03%±0.23%,但菌株4-C對(duì)兩種自由基的清除率均較高。

表3 菌株對(duì)自由基的清除率Table 3 Radical scavenging rate of strains

綜上,試驗(yàn)菌株清除DPPH·的物質(zhì)主要存在于胞外,而清除·OH的物質(zhì)則分布于胞內(nèi),不同菌株間清除自由基能力的差異可能是因?yàn)槠浒舛嗵呛桶麅?nèi)抗氧化應(yīng)激酶系統(tǒng)、硫氧還蛋白(Thioredoxin)系統(tǒng)、谷胱甘肽(Glutathione)系統(tǒng)、巰基氧化還原系統(tǒng)等差異造成[22]。選取對(duì)自由基清除能力較高的菌株4-C、5-D、5-E、9-E進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn),這4株菌株抗氧化能力遠(yuǎn)高于劉珊春[23]與羅章[7]等報(bào)道的菌株,具備較好的研究應(yīng)用價(jià)值。

2.3 抗氧化菌株的16S rRNA基因片段鑒定

試驗(yàn)菌株和標(biāo)準(zhǔn)菌株通過(guò)16S rRNA通用引物F-5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′、R-5′-CCGT CAATTCCTTTGAGTTT-3′擴(kuò)增后會(huì)產(chǎn)生1500 bp左右的片段[12],觀察圖1,發(fā)現(xiàn)在目標(biāo)位置均有單一、明亮的特異性條帶,證明菌株的16S rRNA片段擴(kuò)增成功。觀察菌株基于16S rRNA的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)發(fā)現(xiàn)4-C與Pediococcuspentosaceusstrain LAB2、5-D和5-E與Lactobacillusdelbrueckiisubsp. jakobsenii ZN7a-9T、9-E與Lactobacillusgasseristrain DMBCT6處于同一分支;同時(shí)標(biāo)準(zhǔn)菌株CICC 10396與Enterococcusfaecalisstrain 309-6處于同一分支,與已知相符,說(shuō)明鑒定結(jié)果可信。

圖1 菌株16S rDNA基因擴(kuò)增電泳圖Fig.1 Amplified electrophoresis of strain 16S rDNA注:圖中條帶從左向右依次為marker、4-C、5-D、5-E、9-E。

Lactobacillusdelbrueckiisubsp. Jakobsenii 5-D、5-E是徳氏乳桿菌(Lactobacillusdelbrueckii)新分類的亞種,其模式菌株Lactobacillusdelbrueckiisubsp. Jakobsenii ZN7a-9T分離自布基納法索的一種當(dāng)?shù)佧溠恐l(fā)酵飲料[24],近來(lái)發(fā)酵乳制品中也出現(xiàn)報(bào)道[25],但還罕有對(duì)其抗氧化性等潛在益生特性研究。

圖2 菌株系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree of strain

2.4 抗氧化乳酸菌的耐酸評(píng)價(jià)結(jié)果

胃酸作為人體針對(duì)微生物最大的安全屏障,可殺死絕大多數(shù)通過(guò)口腔進(jìn)入人體的異源微生物,乳酸菌能否在其pH3左右的酸性環(huán)境存活,是后期發(fā)揮益生作用的前提條件[26];同時(shí),乳酸菌定殖的堿性腸道環(huán)境[15]對(duì)生長(zhǎng)影響同樣不可忽視。觀察圖3,發(fā)現(xiàn)4株乳酸菌生長(zhǎng)的最適pH為6～7,強(qiáng)酸和弱堿性脅迫對(duì)菌株的生長(zhǎng)均有不同程度的抑制作用,菌株9-E對(duì)酸表現(xiàn)出較強(qiáng)耐受性,4株菌株對(duì)堿性環(huán)境均具備較好的耐受性。具體表現(xiàn)為:菌株9-E在pH4時(shí)開(kāi)始生長(zhǎng),在pH6～7時(shí)OD595值達(dá)最高(pH6和7 OD595值相比差異不顯著p>0.05),隨著pH的升高,菌株生長(zhǎng)開(kāi)始受到抑制,但pH9時(shí)仍維持在一個(gè)較高的生長(zhǎng)量,與之相比,其他3株菌株的可生長(zhǎng)范圍為pH5～9。觀察圖4,經(jīng)pH3的酸液處理2 h后,4株乳酸菌均表現(xiàn)出較好的耐受性,5-D、5-E、9-E菌株的活菌數(shù)對(duì)數(shù)值處理前后差異不顯著(p>0.05),存活率均在97.86%以上,耐受性稍弱的4-C存活率仍高達(dá)58.07%,維持在106CFU/mL以上。

圖3 不同初始pH對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響Fig.3 Effects of different initial pH values on strain growth注:相同菌株大寫(xiě)字母不同表示差異顯著(p<0.05)，表4同。

圖4 酸處理2 h菌株的活菌數(shù)對(duì)數(shù)值Fig.4 Number of living bacteria of acid treated 2 hours注:相同菌株小寫(xiě)字母不同表示差異顯著(p<0.05)。

2.5 抗氧化乳酸菌的耐膽鹽評(píng)價(jià)結(jié)果

膽鹽是甘氨酸或牛磺酸和膽汁酸結(jié)合形成的鈉(鉀)鹽,在人體消化和吸收脂肪中起到重要作用,同時(shí),膽鹽的高滲透壓性和高效的表面活性劑作用可破壞異源微生物的細(xì)胞膜、改變線粒體膜通透性等造成死亡[27]。由表4可知,4株菌株在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.30%的膽鹽MRS液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)受到不同程度的抑制(差異顯著p<0.05),其中5-D、5-E對(duì)0.3%膽鹽具備較好的耐受性,延滯時(shí)間分別為1.10、3.39 h,但4-C、9-E的生長(zhǎng)受到了較大的抑制作用,延滯時(shí)間分別為6.72、7.49 h。當(dāng)人體進(jìn)食后,膽鹽在十二指腸中維持在0.20%～0.50%之間、空腸中約為0.30%、回腸中約為0.15%,菌株5-D、5-E可耐受0.3%膽鹽,表明其具有在腸道內(nèi)存活繼而發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用的一定潛力[18]。

表4 膽鹽對(duì)菌株平均生長(zhǎng)時(shí)間的影響Table 4 Effects of bile salt on the average growth time of the strain

3 結(jié)論

西藏牧區(qū)9份曲拉和發(fā)酵乳中共獲得62株菌株,經(jīng)篩選發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)菌株清除DPPH·的物質(zhì)主要存在于胞外,而清除·OH的物質(zhì)則分布于胞內(nèi),且同一株菌株對(duì)DPPH·和·OH的清除能力間不存在對(duì)應(yīng)關(guān)系,其中Lactobacillusdelbrueckiisubsp. Jakobsenii 5-D、5-E對(duì)DPPH·和·OH有較高清除能力同時(shí)對(duì)酸、堿和膽鹽均具備較好的耐受性,有較大潛力應(yīng)用于益生菌抗氧化劑的研究與開(kāi)發(fā),對(duì)豐富西藏地區(qū)傳統(tǒng)牦牛乳制品中乳酸菌資源庫(kù)的挖掘工作具有一定意義。