孜然精油抑菌機制

甘芝霖,倪元穎

(1.北京林業(yè)大學生物科學與技術學院食品科學與工程系,北京 100083;2.中國農(nóng)業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院,北京 100083)

植物精油具有較強的抑制或殺死微生物的特性[1-3],尤其以生姜、八角茴香等為代表的香辛料類精油可以作為天然防腐劑應用于食品加工過程中微生物污染的控制[4-5]。

孜然(CuminumcyminumL.)又名安息茴香或孜然芹,芳香氣味濃烈、口感獨特,是一種常見的香辛料和調味品,同時也是一種藥食同源植物[6],其精油具有抗氧化等功效作用[7]。近年來,國內外對孜然精油(cumin essential oil,CEO)的抑菌活性也有一些報道,研究結果表明,孜然精油對細菌、霉菌、酵母菌均有一定的抑制作用[8-10]。但是,大多數(shù)研究只停留在定性分析方面,缺乏理論深度。有關孜然精油對微生物生長曲線、殺菌曲線的影響鮮有報道,其抑菌機制尚不清楚,需要更深入的研究和探討。

本文以大腸桿菌等8種細菌作為供試菌種,首先通過牛津杯實驗、最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)的測定篩選出孜然精油抑制作用最強的兩種細菌,然后繪制生長曲線和殺菌曲線,進一步探究其抑菌活性,最后通過細胞膜相對電導率的測定、透射電鏡和掃描電鏡對菌體形態(tài)變化進行觀察,探討其抑菌作用機理,為孜然精油在食品防腐中的應用提供理論依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

孜然(21-6新孜2號) 產(chǎn)自新疆和田地區(qū),由新疆農(nóng)科院提供,貯藏于4 ℃冷庫中;金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,ATCC6538)、福氏志賀氏菌(Shigellaflexneri,ATCC12022)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae,ATCC13883)、肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae,ATCC49619)、腸炎沙門菌(Salmonellaenteritidis,ATCC13076)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis,ATCC6633)、單增李斯特(Listeriamonocytogenes,ATCC19115)、大腸桿菌(Escherichiacoli,ATCC25922) 上海瑞楚生物科技有限公司;丙酮分析純 北京化工廠;葡萄糖 國藥集團化學試劑有限公司;營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(LB)、水解酪蛋白肉湯培養(yǎng)基(MHB)、腦心浸出液培養(yǎng)基(BHI) 北京奧博星生物技術責任有限公司。

DL-CJ-1F型試驗醫(yī)用型潔凈工作臺 哈爾濱市東聯(lián)電子技術開發(fā)有限公司;BS223S型電子天平 德國Sartorious公司;ZYpureEDlc-100-UP型超純水機 北京中揚永康環(huán)保科技有限公司;YX0602型自動蒸汽滅菌機 山東新華機械股份有限公司;DHP-9082型電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司;T6型新世紀紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司;DW-HL388型86 ℃立式超低溫冷凍儲存箱 中科美菱低溫科技有限責任公司;EC215電導率儀 美國Hanna公司;TGL-16M型高速臺式冷凍離心機 湖南省湘儀集團;FEI Quanta 200型掃描電鏡 捷克FEI公司;H-7650B型透射電鏡 日本日立公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 孜然精油的制備 首先采用超臨界二氧化碳萃取法得到孜然油樹脂(深棕色粘稠狀液體,得率13.56%)[11],然后利用分子蒸餾技術對其進行純化,制備得到孜然精油(金黃色液體,流動性良好,得率25.97%)[12]。用80%的丙酮溶液配制200 μg/mL的孜然精油母液,在4 ℃條件下避光儲存待用。

1.2.2 培養(yǎng)基配制和菌液制備 各種供試菌株分別用合適的培養(yǎng)基進行活化和培養(yǎng)。分別稱取LB、MHB和BHI三種培養(yǎng)基粉末32、24和49 g,加入1000 mL蒸餾水中,加熱煮沸溶解,分裝后于121 ℃高壓滅菌15 min備用。

金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、志賀氏菌于37 ℃下,在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h,然后轉接到MHB培養(yǎng)基于37 ℃下培養(yǎng)24 h,進行二次活化。最后,按照1%的比例(v/v)將上述菌液加入到新的MHB培養(yǎng)基中進行培養(yǎng),采用活菌計數(shù)法測定菌數(shù),使菌液濃度達到107CFU/mL。

沙門氏菌、肺炎鏈球菌、肺炎克雷伯菌、李斯特菌于37 ℃下,在BHI培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h,然后轉接到MHB培養(yǎng)基于37 ℃下培養(yǎng)24 h,進行二次活化。最后,按照1%的比例(v/v)將上述菌液加入到新的MHB培養(yǎng)基中進行培養(yǎng),采用活菌計數(shù)法測定菌數(shù),使菌液濃度達到107CFU/mL。

以上菌株均在搖床中以100 r/min的轉速下進行培養(yǎng)。

1.2.3 牛津杯法測定抑菌譜 參考文獻[13]方法略作修改,按照菌種配制相應的固體培養(yǎng)基,高溫高壓滅菌后以每個大約10 mL的體積倒入平板中,培養(yǎng)基凝固后,加入50 μL菌懸液,然后用涂布棒輕輕涂勻,放置10 min后,用鑷子(無菌)夾取高壓蒸汽消毒且被烘干的牛津杯(內徑6 mm,外徑7.8 mm,高10 mm),輕輕放置于已經(jīng)涂布菌液的培養(yǎng)基上,小心加壓,使其盡量與培養(yǎng)基之間無空隙,每個培養(yǎng)皿內放置三個牛津杯作為平行,分別在不同的牛津杯內緩慢加入50 μL樣品液,其中孜然精油的濃度為0.1 mg/mL,以無菌蒸餾水和丙酮分別為空白對照和溶劑對照。然后將培養(yǎng)皿小心放入4 ℃冰箱中,待樣品液擴散12 h后,將平板倒置放入37 ℃培養(yǎng)箱中,培養(yǎng)24 h后,用游標卡尺測量透明抑菌圈的直徑大小。在該實驗中,抑菌圈直徑越大,代表藥物的抑菌能力越強。

1.2.4 最小抑菌濃度(MIC)與最小殺菌濃度(MBC)的測定 MIC的測定根據(jù)文獻[14]中的液體試管二倍稀釋法略作修改。取8支無菌試管,從1～8進行標號,1～6號為樣品管,7號管為溶劑對照,8號管用無菌蒸餾水作空白對照。1～6號每管加入1 mL無菌培養(yǎng)液,然后向1號管中加入1 mL濃度為200 μg/mL的孜然精油溶液,混勻后,吸取1 mL加入到2號管中,按照上述步驟依次稀釋,到6號管時,從其中吸取1 mL棄掉。7號管中加入1 mL 80%丙酮溶液,8號管中加入1 mL無菌水。接著,每管統(tǒng)一加入1 mL濃度為107CFU/mL處于對數(shù)生長期的菌液,搖勻后加上滅過菌的硅膠塞,在37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)過后用肉眼觀察各個試管,試管中培養(yǎng)液澄清的濃度即為最小抑制濃度(MIC)。然后分別取100 μL MIC(包括MIC)以上的濃度的試管內培養(yǎng)液,接種LB固體培養(yǎng)基上,在37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,觀察平板,沒有菌落生長的最低濃度即為受試菌種的最小殺菌濃度(MBC),選出孜然精油抑制作用最強的兩種細菌。

1.2.5 對微生物生長曲線抑制作用 孜然精油對大腸桿菌和志賀氏菌的生長曲線抑制作用的測定方法按照文獻[15]略作修改,具體如下:將以上兩種供試細菌培養(yǎng)至對數(shù)期,以2%的接種比例(v/v)加入到新的MHB培養(yǎng)基中,根據(jù)1.2.4實驗結果中孜然精油對大腸桿菌和志賀氏菌的MIC值設置濃度,以不加精油組作為對照組。在37 ℃下,以100 r/min在振蕩搖床中培養(yǎng)24 h,每隔2 h,取一定量的菌液用分光光度計測定其吸光值(OD),波長為600 nm。然后以培養(yǎng)時間(h)為橫坐標,OD值為縱坐標,繪制孜然精油對大腸桿菌和志賀氏菌抑制作用的生長曲線。

1.2.6 活菌計數(shù)法測定時間-殺菌曲線 孜然精油對大腸桿菌和志賀氏菌的時間-抑菌曲線的測定方法按照文獻方法略作修改[16],具體如下:將以上兩種供試細菌培養(yǎng)至對數(shù)期(培養(yǎng)時間均為10 h),取一定量菌液接種于MHB培養(yǎng)基之中使其濃度達到108CFU/mL。根據(jù)1.2.4確定的孜然精油的MIC值,配制二者濃度分別為MIC、2×MIC的培養(yǎng)基,在37 ℃下、100 r/min振蕩搖床中培養(yǎng)24 h,分別在0、2、4、6、8、12、16、20、24 h處取1 mL菌液進行梯度稀釋,用LB培養(yǎng)基進行計數(shù),以不加精油組作為對照組。然后以培養(yǎng)時間(h)為橫坐標,各時間點測得的平均菌落數(shù)的對數(shù)值為縱坐標,繪制時間-殺菌曲線。

1.2.7 細胞膜滲透性測定 參照文獻[15]中的方法研究孜然精油對微生物細胞膜滲透性的影響,以相對電導率為指標進行測定。按照1.2.5繪制的生長曲線,將培養(yǎng)至對數(shù)期的大腸桿菌、志賀氏菌菌液在4 ℃下,10000 r/min下離心10 min,棄掉上清液,收集菌體,然后用5%的葡萄糖溶液對菌體進行反復清洗,直到其電導率接近5%的葡萄糖溶液,由此獲得等滲細胞。根據(jù)1.2.4所得孜然精油的MIC值,加入到50 mL 5%的葡萄糖溶液中,測定其電導率并記為L1。將加入兩種藥物的等滲細胞溶液,在37 ℃下培養(yǎng)6 h,每隔1 h測定其電導率記為L2。等滲細胞溶液在沸水中加熱5 min作為對照,記為L0。通過公式(1)計算相對電導率,并繪制時間-相對電導率變化曲線。

相對電導率(%)=(L2-L1)×100/L0

式(1)

1.2.8 掃描電子顯微鏡(SEM)觀察 以1.2.5所述方法加入孜然精油對大腸桿菌、志賀氏菌進行處理,分別于4 ℃、10000 r/min下離心10 min,棄去上清液后收集菌體。首先用含有3%戊二醛的0.1 mol/L PBS緩沖液(pH約7.2)在室溫下固定5 h。然后用PBS緩沖液對其洗滌3次,再用含有1%的四氧化鋨的PBS緩沖液在室溫下固定1 h。然后用25%、50%、75%和100%的乙醇,依次按照順序各脫水一次,每次約10 min。然后用50%、70%、90%和100%的乙酸異戊酯逐級取代乙醇,每級置換約3 min。臨界點干燥之后將樣品用雙面導電膠粘貼在樣品臺上,離子濺射噴金,厚度約1 μm。處理后的樣品可在加速電壓12 kV下觀察,選擇典型視野采集圖像。

1.2.9 透射電子顯微鏡(TEM)觀察 以1.2.5所述方法對大腸桿菌、志賀氏菌進行加藥處理,分別于4 ℃、10000 r/min離心10 min,棄去上清液后收集菌體。首先用含有3%戊二醛的0.1 mol/L PBS緩沖液(pH約7.2)在室溫下固定5 h。然后用PBS緩沖液(同上)對其洗滌3次,在用含有1%的四氧化鋨的PBS緩沖液(同上)在室溫下固定1 h。接著,用30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%的乙醇依次按照順序各脫水一次,每次約20 min,然后再用無水丙酮脫水3次,每次30 min。將脫水后的樣品嵌入到環(huán)氧樹脂812中于45 ℃處理24 h,然后聚合到斯珀爾樹脂中(含有1.5%硬化劑DMP-30的環(huán)氧樹脂812)于65 ℃處理72 h。用超波切片機將以上樣品切成約50 nm的薄片,1%磷鎢酸染色后,在透射電鏡下觀察并采集圖片。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有試驗均做三次重復,用SPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)進行方差分析,用Origin 8.6軟件對數(shù)據(jù)進行擬合并繪圖。

2 結果與分析

2.1 孜然精油抑菌作用定性分析

由表1可得,溶劑對照和空白對照組在所有供試菌種的培養(yǎng)基上均沒有抑菌圈的出現(xiàn),說明丙酮對供試菌種并沒有抑制作用,因此丙酮在本實驗中可以被當做樣品溶劑使用。8種細菌中,孜然精油的抑菌圈從大到小依次為志賀氏菌>大腸桿菌>枯草芽孢桿菌>金黃色葡萄球菌>沙門氏菌>肺炎鏈球菌>肺炎克雷伯菌>李斯特菌。抑菌圈<13 mm為低度抑菌,13～19 mm為中度抑菌,>19 mm為高度抑菌[17],可以判斷,孜然精油對大腸桿菌和志賀氏菌這兩種革蘭氏陰性菌具有高度抑制作用,對枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌具有中度抑制作用,而對肺炎鏈球菌、肺炎克雷伯菌和李斯特菌表現(xiàn)出低度抑制作用。與以往研究相比較[18-19]孜然精油抑菌圈測量結果對比,可以發(fā)現(xiàn)由于產(chǎn)地、品種以及提取方式的不同,孜然精油對同一個菌株產(chǎn)生的抑菌圈大小不相同,即表現(xiàn)出的抑菌作用不同。

表1 孜然精油抑菌活性定性試驗結果Table 1 Qualitative test results of the antimicrobial activity of CEO

孜然精油對供試菌種的MIC和MBC如表1所示。8種細菌中,孜然精油對大腸桿菌和志賀氏菌的抑制作用最強(MIC均為25 μg/mL,MBC均為50 μg/mL)。李大強[20]研究得出,孜然精油對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的MIC分別為123和246 mg/mL,均高于本實驗的結果;而在Oroojalian等[21]的研究中,孜然精油對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的MIC分別為3和0.75 mg/mL,與本實驗的結果同樣存在差異,這進一步說明了孜然精油受產(chǎn)地、種類、提取方式的影響,其抑菌活性等功能性質亦有所不同。

以上實驗結果表明,孜然精油對革蘭氏陰性菌(大腸桿菌和志賀氏菌)作用明顯強于其他供試菌株,因此,在后續(xù)實驗中選取大腸桿菌、志賀氏菌進行深入研究。

2.2 對微生物生長曲線抑制作用

孜然精油對大腸桿菌和福氏志賀氏菌的生長曲線抑制作用如圖1所示,兩種菌的正常生長曲線均在8～10 h開始進入穩(wěn)定期。相比于溶劑對照組變化明顯,MIC組的OD值基本趨于0呈一條直線,說明孜然精油可以有效抑制大腸桿菌和福氏志賀氏菌的繁殖。

圖1 孜然精油對大腸桿菌和福氏志賀氏菌的生長曲線抑制作用Fig.1 Inhibitory effect of CEO on the growth curve of E. coli and S.flexneri

2.3 活菌計數(shù)法測定時間-殺菌曲線

通過活菌計數(shù)法測定孜然精油對大腸桿菌、福氏志賀氏菌的時間-殺菌曲線如圖2所示。溶劑對照組的大腸桿菌和福氏志賀氏菌在培養(yǎng)了12 h后,其從各自初始對數(shù)值分別上升了4.22和2.33;以MIC劑量的孜然精油作用于大腸桿菌24 h后,其對數(shù)值相比于初始值上升了1.43,雖然不能完全抑制其生長,但在一定程度上延長了其延滯期。2×MIC的孜然精油作用于大腸桿菌24 h后,其對數(shù)值下降了0.96。而當兩個劑量的孜然精油作用于福氏志賀氏菌24 h后,活菌數(shù)量均有所下降,分別下降了0.36和0.42個對數(shù)值。以上結果還說明孜然精油的抑菌性存在劑量-作用依賴關系。

圖2 孜然精油對大腸桿菌、福氏志賀氏菌的時間-殺菌曲線Fig.2 Time-kill curves showing the Inhibitory effect of CEO on the growth curve of E. coli,S. flexneri

由圖2還可以看出,兩種細菌的快速增殖期在0～14 h左右,孜然精油在此時間段內可以有效抑制微生物的生長。刁文睿[22]、陶翠等[23]和Yakob[24]的研究顯示,公丁香精油、油樟葉揮發(fā)油和羅勒精油對細菌的抑制作用在0～12 h之內,與本實驗結果相似。

2.4 細胞膜電導率的測定

電導率的測定可以判斷細胞膜通透性改變的情況。孜然精油以MIC劑量作用于兩種供試菌后,其相對電導率如圖3所示。與各自溶劑對照組相比,MIC劑量組的相對電導率都有了明顯提升,其中對福氏志賀氏菌影響相對較大,作用時間4 h后可以提高13%以上。實驗結果表明兩種供試菌受到精油作用后,細胞膜通透性發(fā)生變化,有可能導致細胞內組分泄露,進而導致微生物死亡、生長被抑制。有關報道顯示[25-27],肉桂、八角茴香等植物精油作用于細菌后,微生物的電導率都有明顯上升,說明微生物細胞膜通透性發(fā)生改變,進而導致一些蛋白質、糖類、金屬離子和小分子物質等被釋放出來,使得微生物生長受阻,與本文的研究結果相似。

圖3 大腸桿菌、福氏志賀氏菌生長過程中受到孜然精油作用的相對電導率Fig.3 Relative electrical conductivity of growth matrix of E.coli,S.flexneri with CEO

2.5 掃描電子顯微鏡結果

如圖4A和圖4B，大腸桿菌在精油組和對照組中的形態(tài)有明顯的差異。溶劑對照組中的大腸桿菌細胞結構完整,呈飽滿的長桿狀,表面光滑。精油處理后,部分菌體的形態(tài)發(fā)生改變,皺縮呈不規(guī)則形狀,而且可以看到部分菌體被裂解成聚合在一起的絲狀或片狀溶解物,說明細胞膜被破壞,導致細胞被裂解死亡。

圖4 大腸桿菌(A、B)和福氏志賀氏菌(C、D)的SEM圖(3000×)Fig.4 SEM images of E. coli(A and B)and S. flexneri(Cand D)(3000×)

如圖4C和圖4D，與大腸桿菌的SEM結果相似,溶劑對照組的菌體結構完整,呈飽滿的短桿狀,表面光滑。精油處理后,菌體發(fā)生皺縮,部分菌體被裂解成碎片。說明孜然精油同樣破壞了福氏志賀氏菌的細胞膜,細胞內部組分泄露,導致細胞死亡。

本文的結果存在多個文獻支持,實驗藥物抑菌作用也是通過改變微生物細胞膜的通透性、破壞細胞壁,導致細胞裂解死亡。在Gao等[28]的研究中,迷果芹種子精油對大腸桿菌有一定的抑制作用,起作用的產(chǎn)生也是細胞膜通透性發(fā)生了明顯變化,通過掃描電鏡發(fā)現(xiàn)大腸桿菌的形態(tài)出現(xiàn)褶皺的現(xiàn)象,表面變得粗糙,并伴隨有細胞碎片的產(chǎn)生。

2.6 透射電子顯微鏡結果

如圖5A和圖5B，大腸桿菌在精油組和溶劑對照組中的形態(tài)有明顯的差異。溶劑對照組中的大腸桿菌呈圓形,細胞壁和細胞膜結構完整,胞壁和胞質結合緊密,細胞質密度均勻。精油處理后,部分菌體的形態(tài)發(fā)生改變,呈不規(guī)則形狀,部分細胞的細胞壁遭到破壞,細胞質聚合溶解,使細胞內部出現(xiàn)空腔。

圖5 大腸桿菌(A和B)和福氏志賀氏菌(C和D)TEM圖(6000×)Fig.5 TEM images of E. coli(A and B)and S. flexneri(C and D)(6000×)

如圖5C和圖5D，和大腸桿菌結果相似,福氏志賀氏菌在精油組和溶劑對照組中的形態(tài)有明顯的差異。溶劑對照組中的福氏志賀氏菌呈橢圓形,細胞壁和細胞膜結構完整,胞壁和胞質結合緊密,細胞質密度均勻。精油處理后,菌體形態(tài)發(fā)生改變,收縮呈不規(guī)則形狀,部分細胞的細胞壁遭到破壞,細胞質聚合溶解,使細胞內部出現(xiàn)空腔,并有細胞溶解現(xiàn)象出現(xiàn)。

Diao等[16]發(fā)現(xiàn),公丁香精油作用于大腸桿菌和金黃色葡萄球菌之后,TEM觀察下,細胞結構模糊,菌體內胞質萎縮固化、出現(xiàn)空洞。黃德峰[29]研究發(fā)現(xiàn),菊科中草藥植物精油作用于金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、傷寒桿菌、痢疾桿菌等之后,TEM觀察下,菌體形態(tài)發(fā)生變化、細胞壁膜發(fā)生皺縮、破損、胞內內容物溢出,細胞器模糊不清,胞內形成了大的空泡。

綜上所述,孜然精油具有廣譜抑菌性,對細菌有一定的抑制作用,在8個供試菌種,對大腸桿菌、福氏志賀氏菌的抑制效果相對較好。抑菌作用的機理都是通過改變細胞膜的通透性,使得細胞形態(tài)發(fā)生變化,細胞內的組分泄露流出,導致細胞裂解死亡。與研究報道的孜然精油抑菌作用相比[10,19,31],本實驗中的孜然精油對同一菌種的抑制能力,比如抑菌圈的大小、MIC和MBC等指標并不一致,這可能與孜然的產(chǎn)地和品種、精油的提取方式及供試菌株的來源及活力都有很大的關系。

3 結論

通過牛津杯實驗對孜然精油的抑菌譜進行了測定。結果發(fā)現(xiàn)其對8種供試菌均有一定的抑制作用。對比不同菌株抑菌圈直徑大小發(fā)現(xiàn),孜然精油對大腸桿菌和志賀氏菌有較好的抑制作用。

最小抑制濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)評價實驗中,孜然精油對大腸桿菌和福氏志賀氏菌的抑制作用最強(MIC均為25 μg/mL,MBC均為50 μg/mL),與牛津杯實驗結果相吻合。

孜然精油能顯著提高大腸桿菌、福氏志賀氏菌的相對電導率(p<0.05),通過改變細胞膜的滲透性對微生物起到抑制作用。其中,福氏志賀氏菌的相對電導率最高,達到13%以上。

掃描電鏡和透射電鏡下,發(fā)現(xiàn)孜然精油可以使菌體的形態(tài)發(fā)生改變,細胞普遍出現(xiàn)皺縮、不規(guī)則的凸起,甚至被裂解成碎片,部分細胞的細胞壁遭到破壞,細胞質聚合溶解,使細胞內部出現(xiàn)空腔,從而說明了其抑菌活性的機理是改變了細胞膜的通透性,使得菌體發(fā)生形態(tài)變化,細胞內物質泄漏,導致細胞死亡。