鳳尾魚酶解工藝優(yōu)化及其產(chǎn)物促進(jìn)嗜熱鏈球菌增殖作用

胡凌豪,葛俊苗,宋益善,2,*,陳建康,盛 潔,3,李路瑤,金 禮,雷洲

(1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院,上海 201306;2.上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心,上海 201306;3.國家淡水水產(chǎn)品加工技術(shù)研發(fā)分中心(上海),上海 201306)

鳳尾魚(Anchovy),作為我國長江口的重要經(jīng)濟(jì)魚類和捕撈對象之一,主要分布在東海河口[1]。鳳尾魚作為一種高蛋白低脂肪魚類,除卻必需氨基酸和風(fēng)味氨基酸含量都高以外,還包括谷物中所缺乏的賴氨酸,且含量豐富。但作為一種低值水產(chǎn)品,除了罐頭食品的制作[2],鳳尾魚在食品工業(yè)中的應(yīng)用有限,對其高蛋白特性并未充分利用。

由于海洋和淡水水產(chǎn)資源豐富,具有高蛋白低脂肪的特性,且其本身就含有一些結(jié)構(gòu)新穎、功能特異的活性多肽,因此已經(jīng)成為了制備和獲取多肽的主要來源之一[3]。同時,水產(chǎn)品源蛋白肽不僅具有蛋白質(zhì)的營養(yǎng)特性,還有抑制血管緊張素轉(zhuǎn)化酶、抗氧化、提高免疫、抑制酪氨酸酶、抗疲勞、抗衰老、抗腫瘤、保護(hù)胃黏膜及抗?jié)?、抑制血小板凝結(jié)、促進(jìn)骨形成作用、促進(jìn)皮膚膠原代謝等多種功能活性[4]。

作為酸奶發(fā)酵劑之一的嗜熱鏈球菌由于具有改善腸道功能、提高機(jī)體免疫能力、緩解乳糖不耐癥等多種生理功效[5]而被乳制品工業(yè)廣泛關(guān)注。對于嗜熱鏈球菌的應(yīng)用,一個重要指標(biāo)是其可以大量的生長。然而,由于嗜熱鏈球菌本身缺少蛋白水解酶,因此其增殖需要依靠外界環(huán)境中的肽[6]。相關(guān)研究表明,相比于大分子蛋白,寡肽以及游離氨基酸更容易被嗜熱鏈球菌所利用,且嗜熱鏈球菌對環(huán)境中的寡肽以及游離氨基酸的量有一定的要求[7]。

對于蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)物促進(jìn)嗜熱鏈球菌增殖效果的研究大都局限于大豆蛋白和乳蛋白酶解物等植物性蛋白肽[8-11]。然而對水產(chǎn)源蛋白肽促益生菌生長則鮮有報道。相比植物性蛋白肽,動物性蛋白肽具有自身的特點,如所含人體必需氨基酸種類齊全、各氨基酸的組成比例更合理等。同時,水產(chǎn)源蛋白肽具有易于提取以及成本低廉等特點[12],故可以用于促進(jìn)嗜熱鏈球菌增殖的研究。

因此,本課題組以鳳尾魚為研究對象并進(jìn)行酶解,探討鳳尾魚酶解產(chǎn)物對嗜熱鏈球菌的增殖效果,通過響應(yīng)面法對酶解工藝進(jìn)行優(yōu)化,并對不同分子量的酶解肽的促嗜熱鏈球菌增殖作用進(jìn)行了探索,同時對其抗氧化能力進(jìn)行研究,以期為酸奶等多組分功能性食品的研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鳳尾魚 當(dāng)?shù)厮a(chǎn)市場(中國上海);風(fēng)味蛋白酶 酶活1.38×103U/g，日本天野酶制品株式會社;嗜熱鏈球菌(CICC-20174) 中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心;其余所有化學(xué)試劑 AR，上海麥克林生化科技有限公司。

0.22 μm親水針式濾器 購買自頗爾公司;3、10 kDa超濾管 購買自默克密理博;5 kDa超濾管 購買自賽多利斯公司;721G可見光分光光度計 上海精科上分有限公司;AUY120電子分析天平 臺灣島津科學(xué)儀器股份有限公司;HCJ-2B水浴恒溫磁力攪拌器 常州中誠儀器制造有限公司;FD-1A-50真空冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司;YXQ-LX高壓蒸汽滅菌鍋 上海博迅實業(yè)有限公司;XZ-6G離心機(jī) 湘智離心機(jī)儀器有限公司;ZQLY-300恒溫振蕩培養(yǎng)箱 上海知楚儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 鳳尾魚樣品預(yù)處理 新鮮鳳尾魚放入魚冰比為1∶1 (w/w)的冰盒中運送到實驗室。將鳳尾魚流水洗凈,去除內(nèi)臟后絞碎混勻,直接使用-20 ℃貯藏備用。

1.2.2 鳳尾魚成分的分析 水分含量:5009.3-2016《食品中水分的測定》直接干燥法;蛋白質(zhì)含量:GB 5009.5-2016《食品中蛋白質(zhì)的測定》凱氏定氮法;脂肪含量:GB 5009.6-2016《食品中脂肪的測定》索氏抽提法;灰分含量:GB5009.4-2016《食品中灰分的測定》食品中總灰分的測定。以上實驗均重復(fù)3次。

1.2.3 酶解方法 鳳尾魚酶解工藝優(yōu)化參照Wang等人[13]的實驗方法,并稍作修改。取出凍藏鳳尾魚魚糜,流水解凍后,精確稱量(2.000±0.0002) g鳳尾魚,加入定量的蒸餾水,沸水加熱30 min使蛋白變性,冷卻至50 ℃,使用0.1 mol/L磷酸和0.1 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至7.0±0.01,加入定量風(fēng)味蛋白酶,反應(yīng)一定的時間后,立即放入100 ℃水浴中加熱10 min,滅酶。在4 ℃的條件下過濾,取濾液,凍干,獲得蛋白酶解物(Anchovy Fish Hydrolysate,AFH)。

1.2.4 酶解單因素試驗 在初始pH為7,酶解溫度為50 ℃的條件下,考察酶解時間,料液比和加酶量這三個因素酶解鳳尾魚所得的肽對嗜熱鏈球菌的增殖作用(ΔOD600)。按照1.2.3的方法酶解鳳尾魚,固定料液比為1∶3 g/mL、加酶量為4%的酶解條件下,考察酶解時間(1、2、3、4、5、6、7、8 h)對嗜熱鏈球菌的增殖作用的影響;固定酶解時間為4 h、加酶量為4%的酶解條件下,考察料液比(1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶10、1∶15 g/mL)對嗜熱鏈球菌的增殖作用的影響;固定酶解時間4 h、料液比1∶3 g/mL的酶解條件下,考察加酶量(1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%)對嗜熱鏈球菌的增殖作用的影響。

1.2.5 響應(yīng)面Box-Benhnken中心組合試驗 在單因素實驗結(jié)果的基礎(chǔ)上,每個因素選取三個對嗜熱鏈球菌的增殖作用的影響較大的水平,建立三因素三水平的Box-Benhnken中心組合試驗,以嗜熱鏈球菌的增殖作用為響應(yīng)值,各因素的三個水平采用-1、0、1進(jìn)行編碼,設(shè)計見表1。

表1 響應(yīng)面設(shè)計實驗因素水平和編碼Table 1 Independent variables and their levels used in the response surface design

1.2.6 對嗜熱鏈球菌增殖作用的評價 用1 mL無菌生理鹽水反復(fù)沖洗嗜熱鏈球菌斜面培養(yǎng)基3次,收集菌液并混勻,作為嗜熱鏈球菌種子液;分別取0.1 mL種子液加入5 mL無AFH合成培養(yǎng)液[14]及AFH合成培養(yǎng)液中,37 ℃ 160 r/min培養(yǎng)18 h,分別測其OD600值,嗜熱鏈球菌增殖量計算入下:

ΔOD600=OD600a-OD600b

其中,ΔOD600為嗜熱鏈球菌增殖量,OD600a為嗜熱鏈球菌AFH合成培養(yǎng)液的吸光值,OD600b為嗜熱鏈球菌合成培養(yǎng)液的吸光值。

1.2.7 酶解液中不同分子量多肽的分離及增殖作用評價 利用1.2.5最優(yōu)酶解工藝對鳳尾魚進(jìn)行酶解,將酶解濾液分別裝入3、5、10 kDa超濾管中,4000 r/min離心30 min,獲得4種不同分子量段的多肽液,分別冷凍干燥后,得到相對應(yīng)的酶解肽(<3 kDa:AFH 1;3～5 kDa:AFH 2;5～10 kDa:AFH 3;>10 kDa:AFH 4)。向合成培養(yǎng)液中分別加入AFH 1、AFH 2、AFH 3、AFH 4,使其終濃度為1.0 g/L,獲得4種不同AFH合成培養(yǎng)液。分別加入0.1 mL種子液37 ℃ 160 r/min培養(yǎng)18 h,分別測其ΔOD600值,以期獲得增殖效果最優(yōu)肽段。

1.2.8 最佳增值效果鳳尾魚酶解肽含量評價 向合成培養(yǎng)液中分別加入0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0 g/L增殖效果最優(yōu)蛋白酶解肽,獲得11種不同最優(yōu)AFH合成培養(yǎng)液。分別取0.1 mL種子液加入5 mL 11種不同最優(yōu)AFH合成培養(yǎng)液中,37 ℃ 160 r/min 培養(yǎng)18 h,分別測其ΔOD600值,以確定最佳增值效果的蛋白酶解肽含量。

1.2.9 DPPH+·清除率的測定 DPPH+·清除率的測定參照MarijaLesjak等[15]的方法并稍作修改:用無水乙醇配制終濃度為 0.02 mol/L的DPPH+·乙醇溶液,取100 μL該溶液與100 μL不同濃度的酶解液(AFH水溶液和AFH 1水溶液,0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9、10 mg/mL),室溫避光反應(yīng)30 min并測定混合液的吸光度(A515),VC作為陽性對對照,IC50值通過Excel 2010計算獲得。清除率計算公式為:

I(%)=(A0-A1)/A0× 100

其中：A0為以蒸餾水作為空白組的吸光度值，A1為樣品溶液吸光度值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本研究實驗采用Excel 2010做圖與方差分析,Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行方差及響應(yīng)面分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 鳳尾魚成分分析

對鳳尾魚進(jìn)行成分分析,鳳尾魚整魚(濕基)中蛋白的含量達(dá)到了20.56%±0.007%,水分含量為70.94%±0.033%,脂肪含量為3.94%±0.015%,灰分含量為2.38%±0.03%，具有高蛋白,低脂肪的特點。在本研究中,綜合考慮實際應(yīng)用中工業(yè)化生產(chǎn)操作步驟以及成本,在原材料預(yù)處理的過程中省略除脂的過程,通過后期過濾操作,將脂肪除去。

2.2 單因素實驗

2.2.1 酶解時間對酶解產(chǎn)物促進(jìn)嗜熱鏈球菌增殖效果的影響 由圖1可知,對嗜熱鏈球菌的增殖效果隨酶解時間的增加呈先增大后減小的趨勢,酶解時間在5 h時,嗜熱鏈球菌增殖效果達(dá)到最大值。Juillard等人[16-17]的研究表明,相對于游離氨基酸,嗜熱鏈球菌更傾向于利用環(huán)境中的寡肽進(jìn)行增殖。因此,推測可能的原因是隨著時間的增加,更多的鳳尾魚蛋白被酶解為多肽,但當(dāng)?shù)竭_(dá)一定的時間后,隨著原料的變少和多肽同時被酶解,體系中多肽含量有所降低[13]。由于5～6 h之間促嗜熱鏈球菌增殖未顯差異性,故在響應(yīng)面研究中選擇3、5、7 h作為考察因素。

圖1 酶解時間對嗜熱鏈球菌增殖作用的影響Fig.1 Effect of reaction time on the proliferation of Streptococcus thermophiles注:不同小寫字母表示多重比較差異顯著(p<0.05),圖2、圖3同。

2.2.2 料液比對酶解產(chǎn)物促進(jìn)嗜熱鏈球菌增殖效果的影響 料液比對嗜熱鏈球菌增殖作用的影響可見圖2。隨著料液比逐漸降低,嗜熱鏈球菌的增殖效果先增大,然后減小,在料液比為1∶2時增殖效果最佳。這可能是因為嗜熱鏈球菌的增殖與肽含量有關(guān),當(dāng)料液比值較高的時候,不利于鳳尾魚和風(fēng)味蛋白酶在溶液中的擴(kuò)散,導(dǎo)致酶解時有效接觸面積過低,不利于鳳尾魚蛋白酶解;而當(dāng)料液比值較低時,鳳尾魚和風(fēng)味蛋白酶在溶液中太過于分散,也會導(dǎo)致酶解時有效接觸面積過低,不利于蛋白肽的生成[13],因此在響應(yīng)面研究中選擇1∶1、1∶2、1∶3 g/mL作為考察因素。

圖2 料液比對嗜熱鏈球菌增殖作用的影響Fig.2 Effect of the ratio of material to liquid on the proliferation of Streptococcus thermophiles

2.2.3 加酶量對酶解產(chǎn)物促進(jìn)嗜熱鏈球菌增殖效果的影響 加酶量對嗜熱鏈球菌增殖作用的影響如圖3所示,隨著加酶量的增加,嗜熱鏈球菌增殖效果先逐漸增大,然后降低,當(dāng)加酶量達(dá)到5%時,嗜熱鏈球菌增殖作用最大。其原因可能是在加酶量較低時,風(fēng)味蛋白酶與鳳尾魚接觸不充分,僅有一部分鳳尾魚蛋白酶解成為肽。但當(dāng)酶過多的加入,使得肽進(jìn)一步水解,促嗜熱鏈球菌增殖作用降低[13]。由于4%、5%、6%促嗜熱鏈球菌增殖未顯差異性,故在響應(yīng)面研究中選擇3%、5%、7%作為考察因素。

圖3 加酶量對嗜熱鏈球菌增殖作用的影響Fig.3 Effect of enzyme concentration on the proliferation of Streptococcus thermophiles

2.3 響應(yīng)面Box-Benhnken中心組合實驗

2.3.1 響應(yīng)面Box-Benhnken中心組合實驗方案及結(jié)果 由單因素實驗結(jié)果以及Design-Expert 8.0.6統(tǒng)計分析軟件設(shè)計出的實驗方案及實驗結(jié)果如表2所示,以嗜熱鏈球菌的增殖效果(ΔOD600)為響應(yīng)值,以酶解時間(A)、料液比(B)和加酶量(C)為自變量,建立三因素三水平Box-Benhnken中心組合實驗設(shè)計共包括17個實驗方案,其中12個析因?qū)嶒烖c,5個中心實驗點,用以計算實驗誤差。

表2 響應(yīng)面實驗設(shè)計及嗜熱鏈球菌的增殖效果Table 2 RSM design and theproliferation of Streptococcus thermophiles

2.3.2 回歸方程擬合及方差分析 回歸方程擬合及方差分析數(shù)據(jù)均由Design-Expert 8.0.6統(tǒng)計分析軟件得出,分析結(jié)果見表3,對各因素回歸擬合后,得到回歸方程:

表3 回歸模型及方差分析Table 3 Analysis of variance of regression equation

ΔOD600=-0.11A2-0.092B2-0.057C2-0.0025AB+0.00725AC+0.00825BC+0.04A+0.03B+0.019C+0.57

2.3.3 響應(yīng)面曲線圖分析 響應(yīng)面曲線結(jié)果如圖4所示,圖4(a)～(c)分別為固定加酶量、料液比和酶解時間為0水平時,另外兩個因素的交互作用對嗜熱鏈球菌增殖作用的影響,由圖可知,嗜熱鏈球菌增殖作用隨任意兩個變量的增加呈上升趨勢,當(dāng)達(dá)到某一值時,曲面下降。(a)～(c)圖中所顯示的曲面陡峭程度相近,無法通過結(jié)果圖判斷哪兩個因素之間的交互因素更為明顯,同時方差結(jié)果也表明,任意兩因素間對嗜熱鏈球菌增殖作用的交互作用均不顯著。

圖4 兩因素的交互作用對嗜熱鏈球菌增殖的響應(yīng)面圖Fig.4 Response surface plots of variable parameters on the proliferation of Streptococcus thermophiles

2.3.4 確證實驗 對回歸方程求解,當(dāng)嗜熱鏈球菌增殖作用達(dá)到最大值ΔOD600=0.57時(A,B,C)=(0.19,0.17,0.19),即酶解時間為5.38 h,料液比為1∶2.17,加酶量為5.38%。為方便實際操作,將實驗條件定為酶解時間5.4 h,料液比1∶2.2,加酶量5.4%,取鳳尾魚肉糜進(jìn)行平行驗證實驗,五次平行實驗得到的結(jié)果為0.556±0.017。經(jīng)過確證實驗表明,實際實驗操作值與響應(yīng)面擬合曲線所得的理論值基本相符,證明此酶解工藝獲得的蛋白酶解產(chǎn)物可以有效的促進(jìn)嗜熱鏈球菌的增殖。

2.4 促進(jìn)嗜熱鏈球菌增殖最優(yōu)分子量段的測定

促進(jìn)嗜熱鏈球菌增殖最優(yōu)分子量段的測定結(jié)果如圖5所示?？梢钥闯?四個片段促嗜熱鏈球菌增殖效果的順序為:AFH 1>AFH 2>AFH 4>AFH 3。其中,AFH 1片段促進(jìn)嗜熱鏈球菌增殖效果明顯高于其它片段,說明分子量低于3kDa的鳳尾魚源肽更適于促嗜熱鏈球菌增殖,這與寡肽是乳酸菌生長主要氮源的觀點相一致[6]。

圖5 不同分子量段的酶解產(chǎn)物對嗜熱鏈球菌增殖作用的影響Fig.5 Effect on Streptococcus thermophilesproliferated by fragments with different molecular weights

2.5 AFH1在培養(yǎng)基中最佳含量測定

AFH1在培養(yǎng)基中含量與促嗜熱鏈球菌增殖效果的關(guān)系如圖6所示。嗜熱鏈球菌的促增殖效果隨著AFH1的含量上升逐漸增大,當(dāng)達(dá)到1.2 g/L后增幅平緩。其可能的原因在于AFH1含量較低時,環(huán)境中未能提供足夠的嗜熱鏈球菌生長所需的氮源,因此嗜熱鏈球菌增殖效果低,隨著酶解物含量上升到一定值后,環(huán)境所提供的氮源達(dá)到飽和,因此嗜熱鏈球菌增殖趨于平緩。

圖6 不同含量的酶解產(chǎn)物對嗜熱鏈球菌增殖作用的影響Fig.6 Effect on Streptococcus thermophiles proliferated by growth media with different compositions of anchovy hydrolysate

2.6 DPPH·清除率測定結(jié)果

DPPH·乙醇溶液呈紫色,在515 nm處有強(qiáng)吸收,當(dāng)體系中加入抗氧化性物質(zhì)時,該物質(zhì)能與DPPH+·單電子配對,吸收逐漸消失,進(jìn)而評價清除劑的清除能力[18]。鳳尾魚酶解產(chǎn)物的DPPH+·清除率結(jié)果如圖7所示,以VC作為對照,在濃度低于5 mg/mL的時候AFH1的DPPH·清除作用隨濃度的增大呈遞增趨勢,大于5 mg/mL的時候AFH1的自由基清力趨于穩(wěn)定,清除率達(dá)到70%。這結(jié)果與李雪等人[19]利用風(fēng)胃蛋白酶酶解草魚魚皮對DPPH·清除率結(jié)果(77.3%)相似。AFH1的IC50值為2.73 mg/mL。與此同時,當(dāng)AFH的濃度達(dá)到7 mg/mL時,DPPH·自由基清除作用趨于穩(wěn)定,清除率達(dá)到60%,IC50值為3.18 mg/mL。結(jié)果表明鳳尾魚酶解產(chǎn)物有較好的DPPH·清除能力,且小于3 kDa的分段的多肽DPPH+·清除能力高于未分段的多肽。

圖7 酶解產(chǎn)物對DPPH·清除作用Fig.7 DPPH radical-scavenging actives of anchovy hydrolysate

3 結(jié)論

采用響應(yīng)面法對鳳尾魚酶解工藝促進(jìn)嗜熱鏈球菌增殖進(jìn)行優(yōu)化,建立了促進(jìn)嗜熱鏈球菌增殖的回歸模型,由該模型優(yōu)化的酶解工藝為:酶解時間5.4 h,料液比1∶2.2,加酶量5.4%。此條件下,平均促進(jìn)嗜熱鏈球菌增殖為0.556,與模型預(yù)測相近,進(jìn)一步驗證了改模型的可靠性。通過對不同分子量段的酶解產(chǎn)物促進(jìn)嗜熱鏈球菌增殖的結(jié)果表明,分子量小于3000 Da促進(jìn)嗜熱鏈球菌增殖效果最優(yōu),并且其在培養(yǎng)基中的含量最佳值為1.2 g/L。抗氧化活性實驗結(jié)果表明,鳳尾魚酶解產(chǎn)物對DPPH·有一定的清除能力,說明具有較高的抗氧化活性。