響應面法優化近江牡蠣多糖多肽聯產的酶解工藝

楊大俏,王錦旭,李來好,*,楊賢慶,馬海霞

(1.中國水產科學研究院南海水產研究所,農業農村部水產品加工重點實驗室,廣東省漁業生態環境重點開放實驗室,廣東廣州 510300;2.上海海洋大學食品學院,上海 201306)

牡蠣俗稱蠔或海蠣子,肉質鮮美可口而受到人們喜愛,具有很高的藥用價值[1-2],并且含有豐富的蛋白質[2]和碳水化合物,因其鋅含量極高,富含鐵、鈣等元素,素有“海洋牛奶”的稱號[3]。中國擁有豐富的海洋資源,2016年中國牡蠣行業產量達到483.5萬噸[4],是中國一種重要經濟貝類,但是,目前中國對牡蠣產品除直接食用外,大多通過簡單加工直接進入食品市場,產品附加值不高[5],牡蠣產業發展受到制約。研究生物活性物質是海洋研究的主導方向[6],相關研究報道顯示,牡蠣多糖具有多種藥用功能,對牡蠣多糖的深入研究有利于制藥、功能食品及膳食補充劑等行業的發展[7-8]。天然海洋活性多肽具有較高的穩定性[9],但是海洋魚蝦貝類中的生物活性肽的研究尚處于實驗室階段[7-10]。

目前已有關于牡蠣多糖或牡蠣多肽[11]的提取工藝研究,多采用堿提取法[12]和蛋白酶水解法[13-14],但該類研究多集中在單獨提取多糖分子或單獨提取多肽分子上,關于牡蠣多糖活性分子和多肽活性分子聯產工藝并未見報道。聯產[15-16]制備技術是指利用物理或化學方法同時提取物料中多種有效成分的高效、潔凈利用的生產技術。關于幾種物質同時提取或聯產制備的研究,國內主要集中于油料作物和中草藥活性成分的提取方面,對海洋生物資源尤其是關于高效利用牡蠣的工藝研究還比較少,國外研究在這一方面幾乎還是盲點。本研究旨在得到同時提取近江牡蠣(Ostrearivularis)中功能多糖和活性多肽的工藝,實現近江牡蠣多糖和多肽的聯產制備,以提高近江牡蠣利用率。

本實驗以近江牡蠣為原料,采用單因素試驗研究了酶解時間、酶配比及料液比對多糖[17]多肽聯產的影響,在此基礎上進一步通過響應面法分析了各因素及其交互作用對多肽含量、酸性糖含量及總糖含量的影響,并最終得到最優多糖多肽的聯產工藝條件,以期為連續膜分離聯產制備近江牡蠣多糖及多肽的中試化放大生產提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

近江牡蠣全臟器(于-20 ℃冷凍保藏備用) 廣東省臺山市;Alcalase酶(210 AU·mg-1)、胰蛋白酶(≥250 U·mg-1)、中性蛋白酶(≥100 U·mg-1) 廣州齊云生物技術有限公司;硫酸軟骨素、甘氨酸、氯化鈉、氫氧化鈉、葡萄糖、無水乙醇、三氯乙酸、苯酚、無水硫酸銅、甲醛、鹽酸、濃硫酸(均為分析純) 廣州佳研生物科技有限公司;1,9-二甲基亞甲基藍、Gly-Gly-Tyr-Arg(標準品) 美國Sigma公司。

JYL-C022E料理機 九陽股份有限公司;T50均質機 德國IKA;ZDJ-4A雷磁自動電位滴定儀 上海儀電科學儀器股份有限公司;Sunrise-basic Tacan吸光酶標儀 瑞士TECAN;三聯高壓平板膜設備 廈門福美科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 聯產提取工藝 近江牡蠣全臟器→勻漿→均質10 min→熱水浸提→調pH8.0→酶解→煮沸滅酶→離心→上清液調pH7.0→0.22 μm濾膜除雜→200 kDa膜分離→收集濾過液與截留液→濾過液經8 kDa膜分離[18]→收集8 kDa以下濾過液(粗多肽)、8 kDa以上截留液(粗多糖)→凍干得粗多肽、粗多糖。

1.2.1.1 熱水浸提 將牡蠣勻漿與水混勻后在55 ℃水浴0.5 h。

1.2.1.2 離心 將經過煮沸滅酶后的牡蠣酶解液在9000 r·min-1離心10 min。

1.2.1.3 0.22 μm微濾微濾條件 操作壓力為0.12 MPa,操作溫度為10 ℃。

1.2.1.4 8 kDa膜分離超濾條件 操作壓力為1.05 MPa,操作溫度為10 ℃。

1.2.1.5 200 kDa膜分離超濾條件 操作壓力為0.5 MPa,操作溫度為10 ℃。

1.2.1.6 凍干 旋轉蒸發溫度為55 ℃。

1.2.2 酶種類及添加量的選擇 以近江牡蠣全臟器為原料,勻漿均質、熱水浸提后分別按照質量分數200、400、600、800、1000 mg·L-1(0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%)的添加量添加Alcalase酶、中性蛋白酶和胰蛋白酶三種酶,在55 ℃、pH8.0的條件下單酶酶解2.0 h,酶解液在9000 r·min-1離心10 min,調酶解液上清液pH至中性,測定水解度、多肽含量、酸性糖含量和總糖含量。以酶解液中多肽含量、酸性糖含量及總糖含量的極大值為指標,判定最佳酶解條件。

1.2.3 近江牡蠣肉多糖多肽聯產工藝的單因素實驗

1.2.3.1 酶解時間對近江牡蠣肉多糖多肽聯產工藝影響 取50.0 g近江牡蠣全臟器勻漿均質后,加入150 mL去離子水,于55 ℃熱水浸提0.5 h,調節pH至8.0,加入配比為3∶1的Alcalase和胰蛋白酶(總質量分數為0.8%),在55 ℃下分別酶解0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h。酶解后煮沸滅酶,離心取適量上清液測量水解度以及多肽含量,調節pH至7.0,加入無水乙醇至終體積分數為65%,4 ℃醇沉24 h,過濾取沉淀,丙酮洗滌三次,干燥后配制成溶液檢測酸性糖含量以及總糖含量。以酶解液中多肽含量、酸性糖含量及總糖含量的極大值為指標,判定最佳酶解時間。

1.2.3.2 雙酶配比對近江牡蠣肉多糖多肽聯產工藝影響 在酶解時間為2.0 h,料液比為1∶3的情況下,加入總添加質量分數為0.8%的Alcalase與胰蛋白酶,配比分別為4∶0、3∶1、2∶2、1∶3、0∶4。以酶解液中多肽含量、酸性糖含量及總糖含量的極大值為指標,判定最佳雙酶配比。

1.2.3.3 料液比對近江牡蠣肉多糖多肽聯產工藝影響 在酶解時間為2.0 h,配比為3∶1的Alcalase和胰蛋白酶(總質量分數為0.8%)情況下,分別按照1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5 (g/mL)的料液比添加去離子水。以酶解液中多肽含量、酸性糖含量及總糖含量的極大值為指標,判定最佳料液比。

1.2.4 響應面法優化近江牡蠣肉多糖多肽聯產工藝 通過單因素實驗[19-21]確定選取酶解時間A、雙酶配比B、料液比C作為三因素進行編碼[28],以多肽含量、酸性糖含量和總糖含量作為響應值,實驗因素和水平設計見表1。

表1 響應面試驗因素及水平表Table 1 Factors and levels table of response surface experiment

1.2.5 指標測定 多肽的含量采用三氯乙酸沉淀法[22];水解度的測定依照甲醛滴定法[23-24];總糖含量采用苯酚-硫酸法[25];酸性糖含量的測定采用1,9-二甲基亞甲基藍法[26-27]。其中多肽、總糖、酸性糖含量以mg·50 g-1計。

1.3 數據分析

以上實驗均經過三次重復操作,采用IBM SPSS Statistics 20.0對數據進行統計分析,運用單因素方差分析(ANOVA)檢測平均值顯著性,其中*代表差異顯著(p<0.05),**代表差異極顯著(p<0.01)。

2 結果與分析

2.1 酶種類及添加量的選擇

由圖1可知,隨著3種酶添加量的增加,牡蠣酶解液的水解度升高,且Alcalase水解效果最佳;整體而言,在一定添加量下,Alcalase與胰蛋白酶酶解牡蠣勻漿得到的多肽含量較高;對于酸性糖等大分子物質,胰蛋白酶的酶解效果遠遠大于其它2種酶,中性蛋白酶的酶解效果最差;通過總糖含量結果顯示,Alcalase與胰蛋白酶的酶解效果較好。綜上,選擇Alcalase與胰蛋白酶共同酶解牡蠣勻漿,以期同時得到所需的多糖多肽。

圖1 3種酶不同添加量對近江牡蠣勻漿水解度(a)、多肽含量(b)、酸性糖含量(c)以及總糖含量(d)的影響Fig.1 The effects of three enzymes on the degree of hydrolysis(a),polypeptide content(b),glycosaminoglycan content(c)and total-sugar content(d) of Ostrea rivularis

2.2 單因素實驗結果

2.2.1 酶解時間對近江牡蠣多糖多肽聯產的影響 結果見圖2,隨酶解時間的延長,水解度逐漸升高,但各數值間差異不明顯;多肽含量、酸性糖含量以及總糖含量隨酶解時間延長均出現先增加后下降的趨勢,并在酶解時間2.0 h達到最大值,故最適酶解時間為2.0 h。

圖2 不同酶解時間對近江牡蠣多糖多肽聯產的影響Fig.2 Effects of different hydrolysis time on co-production of polysaccharides and polypeptides simultaneously from Ostrea rivularis

2.2.2 雙酶配比對近江牡蠣多糖多肽聯產的影響 結果見圖3,水解度隨Alcalase酶含量的升高逐漸升高,各數值間差異不明顯;多肽含量、酸性糖含量以及總糖含量隨Alcalase與胰蛋白酶比例變化趨勢一致,并在Alcalase與胰蛋白酶添加比例為3∶1時達到最大值,故最適雙酶配比為Alcalase∶胰蛋白酶=3∶1(總添加質量分數0.8%)。

圖3 酶配比對近江牡蠣多糖多肽聯產的影響Fig.3 Effects of different proportion of enzymes on co-production of polysaccharides and polypeptides simultaneously from Ostrea rivularis

2.2.3 料液比對近江牡蠣多糖多肽聯產的影響 結果如圖4所示,隨料液比的增大,水解度差異不明顯;多肽含量、酸性糖含量和總糖含量隨料液比的增大呈現出先增加后減小的趨勢,并在料液比1∶3 g/mL時達到最大值,故選擇最佳料液比為1∶3 g/mL 。

圖4 料液比對近江牡蠣多糖多肽聯產的影響Fig.4 Effects of different solid-liquid ratios on co-production of polysaccharides and polypeptides simultaneously from Ostrea rivularis

2.3 響應面試驗結果

由圖2～圖4可知,在不同酶解時間、雙酶配比、料液比下,近江牡蠣酶解液的水解度變化差異不明顯,故而在單因素實驗的基礎上,根據Box-Benhken的中心組合實驗設計原理,選取酶解時間A、雙酶配比B、料液比C作為三因素,并以具有顯著性差異的多肽含量Y1、酸性糖含量Y2和總糖含量Y3作為響應值,實驗方案及結果見表2。

表2 響應面試驗設計及結果Table 2 Design and results of response surface experiment

運用Design Expert 8.0軟件對實驗結果進行回歸擬合,得到的回歸方程如下:

為檢驗上述方程的有效性,運用Design Expert 8.0.6軟件對上述結果進行數據分析,可信度分析見表3,方差分析結果見表4。三種響應值的可信度分析的模型相關系數R2分別為0.9352、0.9615、0.9638,都接近于1,表示模型相關度很好;變異系數(C.V.%)分別為8.68、5.39、6.39,說明該數學模型的置信度較好,該模型可以較好地反應試驗的真實值[18]。由表4可知,對于多肽含量、酸性糖含量和總糖含量三個響應值,該模型的F值分別為11.23、19.45、20.72,p值分別為0.0022、0.0004、0.0003均小于0.05,可以判斷模型是顯著的;同時三個響應值的模型失擬項p值均大于0.05,說明模型失擬項不顯著。綜上所述,該回歸模型對三個響應值的擬合程度較好,實驗誤差小。

表4 回歸方程的方差分析Table 4 Analysis of variance(ANOVA)of regression equation

表3 模型的可信度分析Table 3 Reliability analysis of model

料液比對多肽的提取影響極顯著(p<0.01),雙酶配比和料液比對酸性糖的提取具有極顯著的影響(p<0.01),料液比對總糖提取的影響顯著(p<0.05),且該實驗中三個單因素對近江牡蠣肉多肽含量、酸性糖含量、總糖含量影響的排序分別為料液比>酶解時間>雙酶配比、雙酶配比>料液比>酶解時間、料液比>酶配比>酶解時間。

利用此模型可擬合出三個響應值相應的響應面分析圖,響應面三維圖形是響應值對試驗因子(單因素變量)所構成的三維空間曲面圖,可以進一步研究各個變量間的交互作用并確定最優點[20]。當特征值(響應值)變化,三維響應面分析圖呈現相應變化[21]。圖5a表示酶解時間與酶配比交互作用對多肽提取的影響,隨著酶解時間和胰蛋白酶添加比例增加,多肽含量變化不大,呈現輕微增加趨勢,但其交互作用不顯著;圖5b表示酶解時間和料液比交互作用對多肽提取的影響,隨著酶解時間和料液比的增加,多肽含量呈現先增加后降低的趨勢,而且隨著料液比的增加,多肽含量增加顯著且下降趨勢不明顯,以此判斷料液比的對多肽提取的影響顯著高于酶解時間,但其交互作用不顯著;圖5c表示酶配比和料液比交互作用對多肽提取的影響,隨著胰蛋白酶添加比例和料液比的增加,多肽含量先增加后降低,并且料液比的對多肽提取的影響高于酶配比對多肽提取的影響,但其交互作用不顯著。

圖5 酶解時間、酶配比和料液比兩兩交互作用對近江牡蠣多肽提取的影響Fig.5 The effects of hydrolysis time,enzymolysis proportion and liquid-solid ratio on the extraction of polypeptides from Ostrea rivularis注:a:酶解時間與酶配比的交互作用;b:酶解時間和料液比的交互作用;c:酶配比和料液比的交互作用。

圖6a為酶解時間與酶配比的交互作用對酸性糖提取的影響,隨著酶解時間和胰蛋白酶添加比例增加,酸性糖含量增加,但是胰蛋白酶添加比例對酸性糖提取的影響明顯大于酶解時間對酸性糖提取的影響,這與單因素實驗得到的結論一致,但兩者交互作用不顯著;圖6b表示酶解時間和料液比交互作用對酸性糖提取的影響,隨著酶解時間和料液比的增加,酸性糖含量呈現輕微增加趨勢,兩者交互作用不顯著;圖6c表示酶配比和料液比交互作用對酸性糖提取的影響,隨著胰蛋白酶添加比例和料液比的增加,酸性糖含量同樣先增加后降低,料液比的影響不顯著,兩者交互作用不顯著。綜合圖6可以看出,三種因素對酸性糖提取影響的交互作用均不顯著。

圖6 酶解時間、酶配比和料液比兩兩交互作用對近江牡蠣酸性糖提取的影響Fig.6 The effects of hydrolysis time,enzymolysis proportion and liquid-solid ratio on the extraction of glycosaminoglycan from Ostrea rivularis注:a:酶解時間與酶配比的交互作用;b:酶解時間和料液比的交互作用;c:酶配比和料液比的交互作用。

圖7a為酶解時間與酶配比的交互作用對總糖提取的影響,隨著酶解時間和胰蛋白酶添加比例增加,酸性糖含量先增加后減少,兩者交互作用不顯著;圖7b表示酶解時間和料液比交互作用對總糖提取的影響,隨著酶解時間和料液比的增加,總含量呈現先增加后降低的趨勢,但兩者交互作用不顯著;圖7c表示酶配比和料液比交互作用對總糖提取的影響,隨著胰蛋白酶添加比例和料液比的增加,總糖含量先增加后降低,兩者交互作用不顯著。

圖7 酶解時間、酶配比和料液比兩兩交互作用對近江牡蠣總糖提取的影響Fig.7 The effects of hydrolysis time,enzymolysis proportion and liquid-solid ratio on the extraction of total-sugar from Ostrea rivularis注:a:酶解時間與酶配比的交互作用;b:酶解時間和料液比的交互作用;c:酶配比和料液比的交互作用。

以多肽含量、酸性糖含量以及總糖含量為響應值,經Design Expert 8.0.6軟件分析可得最佳工藝條件為酶解2.05 h,添加配比為2.9∶1.1的Alcalase和胰蛋白酶(總質量分數為0.8%),料液比1∶3.65 g/mL,相應的響應面二次模型預測多肽含量最大值為251.10 mg·50 g-1,酸性糖含量最大值為8.57 mg·50 g-1,總糖含量最大值為388.00 mg·50 g-1,三種響應值均為該最佳工藝條件下的最大值。為了驗證該實驗響應面法的可行性,考慮到實際操作問題,選取最佳提取工藝為酶解2.0 h,添加配比為3∶1的Alcalase和胰蛋白酶(總質量分數為0.8%),料液比1∶3.6 g·mL-1,重復三次實驗得到近江牡蠣酶解液中多肽含量(251.70±5.73) mg·50 g-1,酸性糖含量(8.17±0.29) mg·50 g-1,總糖含量(380.66±15.14) mg·50 g-1,與回歸方程預測值相近,說明近江牡蠣多糖多肽聯產工藝是可行的,并在此條件開展以下實驗。

取500.00 g近江牡蠣勻漿,按照所得最佳工藝酶解近江牡蠣,經過超濾膜分離酶解上清液,得粗多糖制品和粗多肽制品,重復3次試驗得,粗多糖凍干品(21.25±0.60) g,得率為21.29%±0.77%,含85.18%±1.00%總糖,20.02%±0.38%酸性糖以及10.84%±0.12%多肽;粗多肽凍干品(31.88±0.71) g,得率為31.41%±0.47%,含84.03%±0.85%多肽,0.11%±0.01%酸性糖以及5.68%±0.15%總糖。

另外,經過8 kDa超濾膜超濾分離后,使用三氯乙酸沉淀法、苯酚-硫酸法、1,9-二甲基亞甲基藍法測定各濃縮凍干粉,其顏色反應證實8 kDa超濾膜分離效果良好,可用于近江牡蠣多糖多肽聯產工藝。

3 結論

近江牡蠣多糖多肽聯產的最優酶解工藝為料液比1∶3.6 g·mL-1,添加配比為3∶1的Alcalase和胰蛋白酶(總質量分數為0.8%),酶解2.0 h。此條件下近江牡蠣酶解液中多肽含量(251.70±5.73) mg·50 g-1,酸性糖含量(8.17±0.29) mg·50 g-1,總糖含量(380.66±15.14) mg·50 g-1。并按此工藝酶解近江牡蠣全臟器勻漿,得粗多糖21.29%±0.77%,含85.18%±1.00%總糖,20.02%±0.38%酸性糖以及10.84%±0.12%多肽;粗多肽得率為31.41±0.47%,含84.03%±0.85%多肽,0.11%±0.01%酸性糖以及5.68%±0.15%總糖。與回歸方程預測值相近,說明近江牡蠣多糖多肽聯產工藝是可行的,能夠同時且最大化地得到近江牡蠣多糖與多肽。