響應面法優化超聲輔助提取薺菜多酚工藝及其抗氧活性研究

曹小燕,楊海濤

(1.陜西理工大學陜西省催化基礎與應用重點實驗室,陜西漢中 723000;2.陜西理工大學化學與環境科學學院,陜西漢中 723000)

薺菜(Capsellabursa-pastoris.)是十字花科植物,在我國分布廣泛[1]。薺菜作為一種藥食同源植物,富含黃酮[2]、多糖[3]、生物堿[4]、氨基酸[5]、微量元素[6]、多酚[7]等多種活性成分,其中多酚是廣泛分布于植物體內的多元酚類次生代謝產物,具有抗氧化活性、抑菌、抗腫瘤、降血糖和調節血脂等多種生物活性[8-9]。植物多酚的提取與分離研究,可為天然抗氧化劑和多酚保健食品的開發提供原料。目前,國內外學者對植物多酚的提取技術已有較多的研究如溶劑浸提法[10]、微波提取[11]、超聲波輔助提取法[12]、酶輔助提取法[13]、超臨界流體萃取法[14]等,其中超聲波輔助提取法具有提取時間短、效率高、成本低和降低高溫對提取物的影響等優點[15],但利用此法提取薺菜多酚的研究目前鮮見報道。

本研究以野生薺菜為原料,在單因素實驗的基礎上結合響應面分析試驗優化了薺菜多酚的提取工藝;借助體外抗氧化模型,評價了薺菜多酚的自由基清除活性,為薺菜多酚功能性食品和保健品的開發提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

薺菜 2017年3～5月采摘于漢中連城山;沒食子酸、Folin-Ciocalteu試劑、抗壞血酸、硫酸亞鐵 阿拉丁試劑;其他試劑 均為國產分析純,南京化學試劑有限公司。

EL104型電子分析天平 梅特勒-托利多儀器上海有限公司;Cary50紫外可見分光光度計 美國瓦里安中國有限公司;WGL-125B型電熱鼓風干燥箱 天津市泰斯特儀器有限公司;SB-4200DTD型超聲波清洗機 寧波新芝生物科技股份有限公司;FW100高速萬能粉碎機 天津泰斯特儀器有限公司;RE-2A旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠;JXL-2S-6A數顯恒溫水浴鍋 江蘇省金壇市金祥龍電子有限公司;SHB-Ⅲ循環水式真空泵 鄭州長城科工貿有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 薺菜預處理及多酚的提取工藝 采集開花期薺菜全草,除雜后樣品分為四份(根、葉、花和全草)置于50 ℃烘箱中烘干至恒重,粉碎后過60目篩于4倍體積的石油醚中脫脂,烘干備用。準確稱取一定量的脫脂樣品于50 mL錐形瓶中,加入一定體積的提取溶劑在一定的超聲溫度和功率條件下,超聲輔助提取一定的時間,于2500 r/min離心機中離心10 min,得到薺菜多酚的提取液,旋轉蒸發儀減壓濃縮提取液,蒸餾水定容于一定體積的容量瓶中,得到薺菜多酚的待測液。

1.2.2 單因素實驗 固定提取時間30 min,提取溫度40 ℃,料液比1∶30 (g∶mL),超聲功率280 W,提取溶劑為甲醇50%、乙醇50%、乙酸乙酯50%、正己烷50%和水,考察不同提取溶劑對薺菜多酚提取量的影響;固定提取溶劑為乙醇,提取時間30 min,提取溫度40 ℃,料液比1∶30 (g∶mL),超聲功率280 W,乙醇濃度為30%、40%、50%、60%、70%,考察乙醇濃度對薺菜多酚提取量的影響;固定乙醇濃度50%,提取溫度40 ℃,料液比1∶30 (g∶mL),超聲功率280 W,提取時間為10、20、30、40、50 min,考察提取時間對薺菜多酚提取量的影響;固定乙醇濃度50%,提取時間30 min,料液比1∶30 (g∶mL),超聲功率280 W,提取溫度為40、50、60、70、80 ℃,考察提取溫度對薺菜多酚提取量的影響;固定乙醇濃度50%,提取時間30 min,提取溫度40 ℃,超聲功率280 W,料液比為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 (g∶mL),考察料液比對薺菜多酚提取量的影響;固定乙醇濃度50%,提取時間30 min,提取溫度40 ℃,料液比1∶30 (g∶mL),超聲功率為240、280、320、360、400 W,考察超聲功率對薺菜多酚提取量的影響。

1.2.3 響應面試驗 以薺菜多酚的提取量為評價指標,結合單因素的實驗結果,采用Box-Behnken中心組合試驗設計的原理,以乙醇濃度、料液比、提取時間和提取溫度四個因素,設計四因素三水平的響應面分析試驗[16],優化超聲輔助提取薺菜多酚的提取工藝。響應面分析因素與水平見表1。

表1 響應面實驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface methodology

1.2.4 多酚含量的測定

1.2.4.1 繪制沒食子酸標準曲線 參考郭彩霞等[17]實驗方法稍作修改。精確配制1 mg/mL的沒食子酸母液,依次配制成質量濃度為0.005、0.010、0.015、0.020、0.025、0.030、0.035、0.040、0.045、0.050、0.055 mg/mL的標準溶液。于10 mL離心管中加入上述標準溶液1 mL,0.1 mg/mL福林酚試劑5 mL,搖勻后反應6 min。加入75 mg/mL Na2CO3溶液4 mL,避光靜置60 min,以蒸餾水做空白對照,于756 nm波長下檢測其吸光度值。以沒食子酸濃度為橫坐標,吸光度值為縱坐標繪制標準曲線,得到線性回歸方程為:y=151.57x+0.0271(R2=0.9998),用于評價薺菜多酚的質量濃度。

1.2.4.2 薺菜多酚的提取量測定 依據標準曲線的繪制方法,測定待測液中薺菜多酚的質量濃度,依據下列公式,計算薺菜多酚的提取量。

K=a×b/m

式中,K為薺菜多酚的提取量,用mg/g表示;a是薺菜提取液中的多酚質量濃度(mg/mL);b為待測液體積(mL);m為所稱取薺菜樣品的質量(g)。

1.3 統計分析

所有數據均為測定三次、取平均值,采用Origin 7.5軟件進行統計分析,結果以平均值±標準偏差表示。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 提取溶劑對薺菜多酚提取量的影響 由圖1可知,5種提取溶劑對薺菜多酚提取量的影響次序為乙醇>丙酮>甲醇>乙酸乙酯>水,其中乙醇所得的多酚提取量最高為(21.93±0.15) mg/g,故提取溶劑選擇乙醇。

圖1 不同提取溶劑對薺菜多酚提取量的影響Fig.1 Effects of different extraction solvents on the contents of polyphenols from Capsella bursa-pastoris

2.1.2 乙醇濃度對薺菜多酚提取量的影響 由圖2可知,薺菜多酚的提取量隨乙醇濃度的增加而增加(30%～50%),50%時達到峰值。當乙醇濃度增大時,降低了溶劑體系的極性,更容易破壞植物體內多酚類物質與多糖、蛋白質等物質間的氫鍵,促使多酚類物質的溶出增加;繼續增加乙醇濃度達到最大值時,溶劑極性較弱,增加了薺菜中的醇溶性物質與多酚的競爭性溶出[22]。故乙醇濃度選擇50%。

圖2 乙醇濃度對薺菜多酚提取量的影響Fig.2 Effects of ethanol concentration on the contents of polyphenols from Capsella bursa-pastoris

2.1.3 提取時間對薺菜多酚提取量的影響 由圖3可知,在10～30 min范圍內,隨著提取時間的延長,薺菜多酚的提取量快速增加,30 min時達到最大值。隨著提取時間的增加,薺菜中的多酚類物質慢慢溶出,30 min時多酚的溶出完全,進一步延長提取時間,由于超聲波的空化作用、機械效應促使多酚類物質發生氧化、聚合等副反應[23],促使提取量降低。因此選擇超聲時間30 min為宜。

圖3 提取時間對薺菜多酚提取量的影響Fig.3 Effects of extract time on the contents of polyphenols from Capsella bursa-pastoris

2.1.4 提取溫度對薺菜多酚提取量的影響 由圖4可知,在40～60 ℃范圍內,隨提取溫度的升高,薺菜多酚的提取量快速增加,提取溫度60 ℃時達到峰值。當提取溫度升高時,促使提取體系內分子的平均動能增加,多酚類物質間的傳質增多,從而增加了多酚的提取量,當提取溫度過高時,高溫會引起多酚類物質的氧化而破壞[24]。故選取60 ℃為較佳的提取溫度。

圖4 提取溫度對薺菜多酚提取量的影響Fig.4 Effects of extract temperature on the contents of polyphenols from Capsella bursa-pastoris

2.1.5 料液比對薺菜多酚提取量的影響 由圖5可知,在液料比1∶10～1∶30 (g∶mL)范圍內,隨著料液比的變化,薺菜多酚的提取量快速增加,1∶30 (g∶mL)時達到最大值。隨著溶劑的增多,增加了薺菜中多酚類物質與溶劑的濃度差,促使了多酚類物質的溶出;當體系中的溶劑量過多時,使得多酚類物質在后處理濃縮過程中的損失增加[25]。故料液比選擇為1∶30 (g∶mL)。

圖5 料液比對薺菜多酚提取量的影響Fig.5 Effects of material-liquid ratio on the contents of polyphenols from Capsella bursa-pastoris

2.1.6 超聲功率對薺菜多酚提取量的影響 由圖6可知,當超聲功率在240～280 W時,薺菜多酚的提取量隨超聲功率的增大而增加,280 W時多酚的提取量達到峰值。繼續加大超聲功率,多酚的提取量緩慢降低,因為在高超聲功率作用下,多酚類的物質成分遭到破壞,從而多酚提取量降低,故在后續實驗中固定超聲功率為280 W。

圖6 超聲功率對薺菜多酚提取量的影響Fig.6 Effects of ultrasonic power on the contents of polyphenols from Capsella bursa-pastoris

2.2 響應面實驗

2.2.1 響應面模型的建立與分析 根據Box-Benhnken實驗設計進行實驗,得到了27組薺菜多酚的提取量如表2所示,并利用Design Expert 8.05軟件對所得到的27組數據進行響應面分析得方差分析結果見表3。對表2的實驗結果進行分析,得到薺菜多酚的提取量(Y)為響應值,乙醇濃度(A)、料液比(B)、提取時間(C)和提取溫度(D)為自變量的四元二次回歸模型為:

表2 響應面分析實驗的設計及結果Table 2 Experimental design for response surface analysis and corresponding experimental data

Y=-65.03625+0.37617A+2.61217B-1.27100C+2.08833D+0.014125AB+0.016325AC+9.62500E-003AD-5.7500E-004BC-0.021325BD+0.015575CD-0.018763A2-0.031513B2-6.93750E-003C2-0.020337D2

表3 響應面的方差分析結果Table 3 Variance analysis result of regression surface analysis

2.2.2 驗證實驗 通過分析響應面試驗模型,預測得到薺菜多酚提取量的最大響應值為Y=28.35 mg/g,即乙醇濃度為48.11%、料液比為1∶33.11 (g∶mL)、提取時間為27.40 min,提取溫度為56.84 ℃,為了便于實際操作,設定乙醇濃度為48%,料液比1∶33 (g∶mL)、提取時間為27 min,提取溫度為57 ℃,平行三次實驗得到薺菜多酚提取量的平均值為28.33 mg/g,與模型預測值28.35 mg/g相比,其相對誤差為0.07%。以此最佳條件,評價薺菜不同部位的多酚提取量見表4。由表4可以看出,不同部位的薺菜多酚提取量不同,其多酚含量由高到低的順序為:薺菜葉>全草>花>根。其中人們常吃的薺菜葉中的多酚提取量最高,為充分開發功能性薺菜食品提供一定的實驗依據。

表4 不同部位薺菜多酚提取量的測定結果Table 4 Determination results of polyphenol extraction yield in different parts of Capsella bursa-pastoris

2.3 薺菜多酚的體外抗氧化活性分析

2.3.1 薺菜多酚對羥基自由基(·OH)的清除能力 采用鄰二氮菲-Fe2+氧化法評價了薺菜多酚清除·OH的能力。由圖7可知,薺菜多酚具有明顯的清除·OH的能力,但清除活性弱于同濃度條件下的VC溶液。當樣品濃度為0.21 mg/mL時,VC溶液對·OH的清除率高達80.82%±0.40%,其清除IC50值為(0.08±0.01) mg/mL;而同濃度條件下薺菜多酚提取液的清除率為61.32%±0.45%,其清除IC50值為(0.17±0.01) mg/mL,說明薺菜多酚對·OH具有較強的清除能力。

圖7 薺菜多酚與VC對·OH清除活性Fig.7 Scavenging ·OH activity ofCapsella bursa-pastoris polyphenols and VC

圖8 薺菜多酚與VC對清除活性Fig.8 Scavenging activity ofCapsella bursa-pastoris polyphenols and VC

2.3.3 薺菜多酚對亞硝酸鹽(NaNO2)清除能力 在弱酸性條件下,亞硝酸鹽和對氨基苯磺酸能發生重氮化反應,再與鹽酸萘乙二胺偶合生成紅色化合物,通過測定540 nm處吸光度值的變化,得到反應液中亞硝酸鈉的含量。由圖9可知,在所測定的實驗濃度范圍內,薺菜多酚和VC溶液對亞硝基的清除率均隨其濃度的增加而增加。薺菜中的多酚提取物具有明顯的清除亞硝酸鹽能力,但其清除效果弱于同濃度條件下的VC溶液。在濃度為42 μg/mL時,VC溶液對亞硝基的清除率78.76%±1.27%,其清除IC50值為(16.2±0.01) μg/mL;而薺菜多酚提取液的清除率為75.05%±1.23%,其清除IC50值為(18.9±0.02) μg/mL。表明薺菜多酚具有一定的清除亞硝酸鹽活性。

圖9 薺菜多酚與VC對NaNO2清除活性Fig.9 Scavenging NaNO2 activity ofCapsella bursa-pastoris polyphenols and VC

2.3.4 薺菜多酚的還原能力 由圖10可知,在測定的質量濃度范圍內,薺菜多酚的還原力隨著質量濃度的升高而增強且量效關系顯著,但弱于同濃度條件下VC溶液的還原能力。實驗結果表明薺菜多酚具有一定的還原能力,證明薺菜多酚提取液是一種良好的自由基清除劑,具有一定的抗氧化活性。

圖10 薺菜多酚和VC的還原能力Fig.10 Reduction ability of Capsellabursa-pastoris polyphenols and VC

3 結論

薺菜多酚提取的最佳工藝條件為:乙醇濃度為48%,超聲提取時間為27 min,提取溫度為57 ℃,料液比為1∶33 (g∶mL),得到薺菜多酚的提取量為(28.33±0.08) mg/g。在此最佳工藝條件下,測定了薺菜葉、花、根的多酚提取量分別為(30.95±0.04)、(27.52±0.14)、(20.42±0.03) mg/g。

本研究不足之處在于對薺菜多酚的抗氧化評價為體外活性評價模型,下一步應采用細胞或小鼠等體內模型評價其抗氧化性,為其生理學活性的合理解釋提供實驗依據。