D手性肌醇對高糖導致氧化損傷線蟲延緩衰老的作用及機制

王 慧,趙 江,楊勝楠,張曉寒,程 靜,王 浩

(天津科技大學食品工程與生物技術學院,天津 300457)

肌醇是羥基環己醇,屬于水溶性B族維生素,共有9種同分異構體[1],而D-手性肌醇(DCI)在自然界中廣泛存在于蕎麥、大豆等植物中,屬于光學活性體的一種肌醇[2]。DCI具有降血糖、抗炎、抗癌、提高耐力等多種生物活性,有研究發現,在果蠅飲食中添加DCI可以顯著延長果蠅的壽命[3],也有文獻報道,一定劑量的DCI能夠促進胰島素抵抗HepG2細胞對葡萄糖的吸收[4]。但近年來,對于DCI的研究多在降血糖、抗衰老方面,對高糖膳食導致氧化損傷的機體延緩衰老的作用未見報道。

自由基學說認為,機體代謝過程中產生的大量ROS自由基能夠導致細胞成分發生氧化損傷從而導致衰老。而機體在受到各種氧化應激的過程中會產生ROS自由基,ROS積累使氧化系統失衡,引起機體衰老[5]。在高脂環境中,生物膜成分更易受到自由基的攻擊而發生過氧化損傷,從而使機體加速衰老[6]。而抗氧化劑可以清除體內多余的自由基,延緩氧化損傷。

表1 線蟲抗衰老基因 mRNA 表達水平測定用 PCR 引物Table 1 PCR primers used to measure the mRNA expression levels of anti-aging genes in Caenorhabditis elegans

秀麗隱桿線蟲是一種小型土壤線蟲,其遺傳信息與信號通路相對保守[7],生命周期短暫,適合短期內構建驗證實驗,而且線蟲隨著年齡的增加,會表現出行為遲緩,生理功能減退等現象。因此,秀麗隱桿線蟲是研究衰老作用比較理想的模式生物[8]。

因此,本實驗以秀麗隱桿線蟲為實驗模式生物,研究DCI對高糖氧化損傷的線蟲延緩衰老的作用,觀察其正常壽命變化并進一步研究其保護機制,為相關DCI的抗氧化產品開發應用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

野生型秀麗隱桿線蟲 北京生命科學研究所王曉晨研究員贈送;D-手性肌醇 上海諾金科生物科技有限公司(純度 95%);超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)試劑盒、過氧化氫酶(catalase,CAT)試劑盒 南京建成生物工程研究所;Trizol試劑、cDNA合成試劑盒和SYBR Green 寶生物生物工程有限公司。

HWS-850智能恒溫恒濕培養箱 寧波海曙賽福實驗儀器廠;UVmini-1240紫外/可見分光光度計 日本島津公司;Real Time-PCR儀 美國BIO-RAD公司;倒置熒光顯微鏡 Olympus。

1.2 實驗方法

1.2.1 線蟲的培養 線蟲基礎NGM培養基的培養基成分參考文獻[9];高糖培養基:在基礎培養基中加入1%的葡萄糖。空白對照組線蟲在基礎NGM培養基中培養,高糖模型組線蟲在高糖培養基中培養,實驗組線蟲則分別培養在添加0、5、10、20 μm/L的DCI的高糖培養基中。

1.2.2 油紅O染色實驗 將0.5 g油紅O染料溶解于100 mL異丙醇中,配制成油紅O溶液,將油紅O溶液與蒸餾水以3∶2 (v/v)的比例混合,沉淀過濾后作為儲備液備用。收集同期化線蟲,按照壽命實驗中的飼養方法培養。當線蟲分別培養至10 d時,用PBS緩沖液沖洗收集線蟲。線蟲首先用多聚甲醛固定,-80 ℃下冷凍15 min后,于43 ℃水浴解凍,PBS沖洗3次后,用1% Triton X-100的油紅O儲備液浸泡30 min,PBS沖洗后,將空白對照組與高糖模型組線蟲挑至1%濃度的瓊脂糖凝膠上,于倒置熒光顯微鏡下觀察脂滴含量并拍照[10]。

1.2.3 壽命實驗 將5 d齡體內帶卵的線蟲用M9緩沖液沖下,加入裂解液裂解后,20 ℃靜置過夜,得到L1期線蟲,將其接種到涂有大腸桿菌OP50的NGM培養基上,20 ℃培養48～54 h,即得到用于實驗的L4期線蟲。將同期化線蟲隨機分為5組:空白對照組、高糖模型組和DCI處理組(5、10和20 μm/L),每組 3 板,每板30 條。每2 d更換一次相應的新鮮培養基,每組培養基需加入150 mm/L的五氟尿嘧啶來抑制線蟲繁殖,同時觀察線蟲的生存狀況,直至線蟲全部死亡為止[9]。

1.2.4 脂褐素水平的測定 收集同期化線蟲,按照壽命實驗中的飼養方法分別培養10 d。配制1%濃度的瓊脂糖凝膠,每個平面挑取線蟲4～5條,NaN3麻醉,倒置熒光顯微鏡下,激發340～380 nm,發射430 nm,觀察線蟲體內脂褐素水平,拍攝熒光圖片,利用Image J軟件分析處理線蟲體內脂褐素熒光水平。

1.2.5 ROS水平的測定 收集同期化線蟲,按照壽命實驗中的飼養方法培養。當線蟲分別培養至10 d時,用PBS緩沖液沖洗收集各組線蟲于避光條件下加入DCFDA 探針儲備液,PBS沖洗3次后,于激發485 nm、發射530 nm波長條件下,拍攝熒光圖片[11]。

1.2.6 線蟲抗氧化酶活力的測定 與壽命生存試驗培養方法相同,培養6 d后,轉移至EP管中,將線蟲用生理鹽水冰浴勻漿后,4 ℃、2500 r/min 離心,收集上清液。采用試劑盒測定線蟲體內SOD酶和CAT酶活力。

1.2.7 線蟲體內抗氧化基因mRNA表達水平的測定 將同期化2 d齡線蟲培養6 d后,轉移至EP管中。生理鹽水洗滌后放入-80 ℃冰箱備用。利用Trizol法提取mRNA,反轉錄得到cDNA,再利用Real-time PCR法以gpd-1為看家基因,檢測age-1、daf-2、sir-2.1、sod-3、daf-16、ctl-1基因mRNA表達水平。

1.3 數據處理

數據使用 SPSS statistics17.0 軟件進行統計分析,單因素方差分析進行顯著性檢驗,p<0.05認為存在顯著性差異,p<0.01認為存在極顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 高糖對線蟲體內脂滴的影響

油紅O作為一種油性染料,可以高度溶解于脂肪。由圖1可知,經過高糖喂養之后的線蟲體內脂滴明顯增多,且線蟲個體較對照組相比較大。Matsuyama等[12]通過研究表明,一定濃度的葡萄糖可以顯著增加線蟲體內的脂肪積累。而線蟲在高脂情況下,生物膜更易受到自由基攻擊而發生氧化損傷,加速衰老,Schultz等[13]也以葡萄糖代謝功能障礙的線蟲為模型發現,葡萄糖干預后能夠顯著降低線蟲的壽命。

圖1 200x顯微鏡下高糖對線蟲體內脂滴的影響Fig.1 Effect of high glucose on lipid droplet in C. elegans by 200x microscope

2.2 DCI對高糖損傷線蟲壽命的影響

從表2中可以看出,喂養1%的葡萄糖后,高糖模型組線蟲的平均壽命與半數死亡時間與對照組相比極顯著降低(p<0.01)。與模型組相比,喂養DCI的高糖損傷組線蟲平均壽命和最高壽命與半數死亡時間均有所增加,且DCI攝入量與損傷組線蟲的壽命呈劑量依賴關系,其中20 μm/L的DCI組高糖損傷線蟲的平均壽命和最高壽命均顯著升高(p<0.05)。因此,DCI能夠延長高糖損傷線蟲的存活時間,延緩氧化損傷過程,對其有一定的保護作用。此外,HadaB等[3]也通過研究發現,喂養一定劑量的DCI能夠顯著延長果蠅的壽命。

表2 DCI對高糖損傷線蟲壽命的影響Table 2 Effect of DCI on the lifespan in C. elegans damaged by high glucose

2.3 DCI對高糖損傷線蟲脂褐素含量的影響

線蟲體內脂褐素隨年齡增長而增多,可作為線蟲機體衰老有效的生物標志。由圖2可知,高糖損傷組線蟲與對照組相比脂褐素水平極顯著增加(p<0.01)。因此,高糖喂食能夠加速線蟲的機體衰老。與高糖損傷模型組相比,高糖給藥組脂褐素熒光強度降低,其中10 μm/L的DCI組線蟲體內的脂褐素熒光值較高糖組相比顯著降低(p<0.05),20 μm/L的DCI組線蟲體內的脂褐素熒光值較高糖組相比極顯著降低了21%(p<0.01)。因此,一定含量的DCI能夠有效降低高糖損傷線蟲體內的脂褐素水平,延緩其機體衰老。

圖2 DCI對高糖損傷線蟲體內脂褐素相對含量的影響Fig.2 Effect of DCI on the content lipofuscin in high glucose-treated C. elegans注:脂褐素相對含量即線蟲體內脂褐素自發熒光面積與線蟲身體面積之比;和對照組相比,# p<0.05,## p<0.01;和模型組相比,*p<0.05,**p<0.01。

2.4 DCI對高糖損傷線蟲體內ROS水平的影響

由圖3可知,與對照組相比,高糖損傷組線蟲ROS水平極顯著升高(p<0.01)。機體在受到氧化損傷時會產生ROS自由基,ROS積累使氧化系統失衡,引起機體衰老。而給予高糖損傷線蟲5、10 μm/L的DCI后,ROS相對含量與模型組相比顯著降低(p<0.05),給予高糖損傷線蟲20 μm/L的DCI后,ROS相對含量與模型組相比極顯著降低(p<0.01)。因此DCI能降低線蟲體內的ROS含量,有效降低高糖膳食對果蠅的氧化損傷作用。

圖3 DCI對高糖損傷線蟲體內ROS相對含量的影響Fig.3 Effect of DCI on the content ROSin C. elegans damaged by high glucose注:ROS相對含量即線蟲體內ROS發射熒光面積與線蟲身體面積之比;和對照組相比,#p<0.05,##p<0.01;和模型組相比,*p<0.05,**p<0.01。

2.5 DCI對高糖損傷線蟲抗氧化酶活力的影響

SOD和CAT是線蟲體內兩種重要的抗氧化酶[14]。由圖4可知,給予一定劑量的DCI后,高糖損傷線蟲的抗氧化酶活力與模型組相比有所升高,其中喂養20 μm/L DCI的線蟲體內的SOD活力和CAT活力分別提高了28.9%和58.9%。因此一定劑量的DCI能夠增強線蟲的抗氧化性,這可能是其發揮抗衰老的作用機制之一。此外張澤生等[15]研究了DCI的不同劑量對小鼠體內抗氧化系統的影響也發現,DCI能夠顯著升高小鼠不同組織的SOD、CAT活力,對衰老的小鼠具有延緩衰老的效果。

圖4 DCI對高糖線蟲SOD、CAT酶活力的影響Fig.4 Effect of DCI on SOD and CAT activity in C. elegans damaged by high glucose注:和對照組相比,# p<0.05,## p<0.01;和模型組相比,*p<0.05,**p<0.01。

2.6 DCI對高糖損傷線蟲抗衰老相關基因轉錄水平的影響

由圖5可知,與模型組相比,喂藥組高糖損傷線蟲的age-1、daf-2基因表達水平降低,其中給予20 μm/L DCI的高糖損傷組線蟲體內的age-1基因表達水平極顯著下調(p<0.01),而給予20 μm/L DCI的高糖損傷組線蟲體內的sir-2.1、sod-3、daf-16、ctl-1基因與模型組相比顯著上調(p<0.05)。胰島素信號通路可以調控線蟲衰老,而daf-2、age-1、daf-16基因是該通路中與線蟲壽命有關的信號因子。daf-2是胰島素/胰島素樣生長因子受體家族的同族體[16],age-1為哺乳動物磷脂酰激酶-3-羥基激酶的同族體[17],daf-16為叉頭轉錄因子的同族體,其靶基因為sod-3、ctl-1[18-19]。在胰島素信號通路中,線蟲體內的DAF-2受體與胰島素配體結合后可磷酸化AGE-1[17],AGE-1又可通過AKT-1/AKT-2/SGK-1通路引起DAF-16磷酸化[20]。Abbas等[21]研究發現,兒茶素能夠影響線蟲體內的daf-2 胰島素信號轉導過程,從而減少線蟲氧化損傷并延長其壽命。此外近些年也有研究表明,齊墩果酸能夠激活daf-16基因延長線蟲壽命,同時,sod-3、ctl-1基因的mRNA也過度表達[22]。ctl-1是編碼細胞質基質過氧化氫酶的基因,其過度表達可以延長線蟲壽命,提高氧化應激耐受能力[23]。而sir-2.1作為線蟲體內的長壽基因,其過度表達可以增強線蟲氧化應激抵抗,Berdichevsky等[24]研究發現,sir-2.1基因突變的線蟲對應激表現更敏感。因此,一定劑量的DCI能夠通過調節與壽命相關的基因來延長高糖損傷組線蟲的壽命,對其起到一定的保護作用。

圖5 DCI對高糖損傷線蟲體內延緩衰老相關基因mRNA表達水平的影響Fig.5 Effect of DCI on mRNA expression level about anti-aging genes in C. elegans damaged by high glucose注:和對照組相比,# p<0.05,## p<0.01;和模型組相比,*p<0.05,**p<0.01。

3 結論

本實驗結果表明,10、20 μm/L的DCI能夠顯著延長高糖損傷線蟲的平均壽命(p<0.05),而20 μm/L的DCI極顯著降低線蟲體內脂褐素和ROS水平(p<0.01)。此外,20 μm/L劑量組氧化損傷線蟲體內SOD和CAT活力顯著增加(p<0.05),age-1、daf-2基因mRNA 表達水平顯著下調(p<0.05),而sir-2.1、sod-3、daf-16、ctl-1基因的mRNA表達水平顯著上調(p<0.05)。因此DCI對高糖導致氧化損傷線蟲有保護作用,而延緩線蟲衰老的作用機制可能與其調控抗衰老相關基因的表達有關。本實驗結果為相關DCI抗氧化保健產品開發應用提供科學依據,但本次研究只局限于生理表層和基因表達方面,將來更需要通過蛋白質組學和代謝組學實驗進行評價分析,為DCI在食品工業中的開發提供理論幫助。