電化學生物傳感器在黃曲霉毒素檢測中的應用研究進展

惠媛媛,王畢妮,彭海霞

(陜西師范大學食品工程與營養科學學院,陜西西安 710119)

黃曲霉毒素(Aflatoxin,AF)主要是由黃曲霉和寄生曲霉產生的次級代謝產物,目前已分離鑒定出18種,主要為AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、AFM1、AFM2[1-3]。黃曲霉毒素具有高毒性和強致癌性,其毒性為氰化鉀的10倍,砒霜的68倍;致癌力為已知致癌物二甲基亞硝胺的70倍、奶油黃(甲基偶氮苯)的900倍[4-6]。在濕熱條件下,黃曲霉毒素極易污染玉米、花生、大豆、小麥、堅果等農產品和制品,極少劑量就可使人和動物受到嚴重的危害,例如畜禽食用含有黃曲霉毒素的飼料后會使其生長緩慢,采食量降低,發病率上升[7-8]。人誤食含有黃曲霉毒素的食品后也會對身體造成很大的危害,如運動失調、排泄停止、肝炎、黃疸等,嚴重時可導致肝癌、骨癌、腎癌、乳腺癌甚至死亡[9-10]。

鑒于黃曲霉毒素的危害巨大,世界各國對食品和飼料中的黃曲霉毒素含量都制定了限量標準,歐盟委員會規定人直接食用的食品或者用作食品配料的制品(不包括開心果、杏仁、榛子、巴旦木和巴西堅果)AFB1含量≤2 μg/kg,AF總量(B1+B2+G2+G2)≤4 μg/kg[11]。美國聯邦政府有關法律規定,飼料中的AF ≤15 μg/kg,牛奶中AFM1≤0.5 μg/kg[12]。我國現行業標準中對食物中AFB1的含量也進行了嚴格規定,乳及乳制品中AFM1≤0.5 μg/kg,嬰幼兒食品及乳粉中的AF不得檢出,玉米、花生、花生油中AFB1≤20 μg/kg,大米、其他食用油為AFB1≤10 μg/kg,豆類、發酵食品為AFB1≤5 μg/kg[13]。這些極其嚴格的限量要求,使得黃曲霉毒素的檢測成為食品和飼料中的研究熱點。

目前國內外報道的測定黃曲霉毒素的方法主要有:薄層色譜法(TLC)[14]、高效液相色譜(HPLC)[15-16]、酶聯免疫法(ELISA)等[17]。雖然這些方法靈敏度高、重現性好,但是樣品處理復雜,檢測儀器昂貴,檢測成本較高,且需專業人員操作,不適合對黃曲霉毒素進行快速有效的檢測分析。然而,電化學生物傳感器不僅能滿足以上要求,還具有成本低廉、應用范圍廣、自動化程度高等獨特的優勢,在臨床檢驗、藥品分析、環境監測、生命科學和食品安全等方面得到了廣泛的應用,已成為分析界中最活躍的領域之一[18-20]。

近年來,在黃曲霉毒素傳感器的構建領域,國內外學者進行了多方面的研究,分別構建了以抗體、酶和核酸適體作為識別元件的電化學生物傳感器,并將酶催化技術、滾環擴增技術、DNA自組裝放大技術、離子液體、納米材料、導電聚合物、過渡金屬化合物等應用于黃曲霉毒素的檢測中[21-27],極大地提高了傳感器的靈敏度、特異性、重現性和再生性。本文主要綜述了近年來電化學酶傳感器、電化學免疫傳感器、電化學適體傳感器在測定食品中黃曲霉毒素的研究進展,介紹了各類電化學生物傳感器的原理、檢測范圍及檢出限,并對當前的研究狀況進行探討和展望,以期為黃曲霉毒素的檢測提供新的電化學生物傳感分析方法,為霉菌毒素的食品現場快速檢測方法的研究提供新思路。

1 電化學免疫傳感器在黃曲霉毒素檢測中的應用

電化學免疫傳感器主要是通過抗原抗體的特異性識別能力,實現定性和定量的分析檢測,其按照在免疫分析過程中是否使用標記物可分為:非標記型的免疫傳感器和標記型免疫傳感器;電化學免疫傳感器按照測量信號的種類則可分為:電勢型、電導型、阻抗型和電流型四種,其中電流型免疫傳感器是目前研究最為成熟、應用最廣泛的一種[28]。表1列出了近十年的用于黃曲霉毒素檢測的電化學免疫傳感器的應用。

表1 電化學免疫傳感器在黃曲霉毒素檢測中的應用Table 1 Application of electrochemical immunosensor in the detection of aflatoxin

1.1 電流型免疫傳感器

電流型免疫傳感器是一種標記性的免疫分析,常用的標記酶有堿性磷酸酯酶(alkaline phosphatase,ALP)[29-31]、辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)[32-33],檢測方法有夾心法和競爭法兩種。

競爭法可以分為直接競爭法和間接競爭法,直接競爭法主要是電極表面的抗原與待測的抗原競爭結合酶標抗體,導致電流信號發生改變的過程。Azri等[34]采用直接競爭法對棕櫚仁餅干和飼料樣品中AFB1進行測定,用多壁碳納米管和離子液體修飾電極,通過共價鍵將牛血清蛋白(bovine serum albumin,BSA)與AFB1復合物(BSA-AFB1)固定在電極上,該傳感器的檢測范圍為(1×10-4～10) ng/mL,檢出限為0.0001 ng/mL。同樣是以直接競爭法的原理對牛奶中的AFM1進行測定,Parker等[35]用HRP作標記,將AFM1抗體固定在絲網印刷電極上制備的傳感器的檢測范圍為(3.9×10-4～1) ng/mL,檢出限為3.9×10-4ng/mL。Tang等[36]也采用直接競爭法對AFB1進行檢測,通過戊二醛將BSA-AFB1復合物固定在核-殼結構的磁性納米顆粒上(CoFe2O4-SiO2),在外加磁場的作用下BSA-AFB1聚集在銦錫氧化物的電極表面,該方法已成功應用于紅甜椒樣品中AFB1的檢測中,檢測范圍為(0.05～12)ng/mL,檢出限為0.006 ng/mL,與經典的ELISA法相比,結果穩定,且簡化了樣品的前處理。由于制備酶標抗體比較復雜,所以一般采用間接競爭法來檢測物質的含量。間接競爭法電極表面的抗原和待測抗原競爭結合了待測溶液中的抗體(一抗)后,然后加入標記的二抗結合溶液中的一抗,加入底物后測量電信號的變化的過程[37]。Tan等[38]在間接競爭原理的基礎上,報道了一種銀沉積信號放大傳感器,用于檢測大米中的AFB1,通過測定銀離子的量,進而獲得溶液中AFB1的量。在最佳條件下,該免疫傳感器測定范圍(0.1～10 ng/mL),檢出限為0.0602 ng/mL。Piermarini等[39]基于同樣的原理,通過96孔絲網印刷微電極測定AFB1,對于玉米中AFB1的檢測范圍為0.05～2 ng/mL,相比于單個的絲網印刷微電極,該方法提高了分析通量,減少了分析時間,降低了分析成本,具有很大的可行性。

夾心法是用酶標記抗體,與固定在電極表面的抗體相結合的抗原形成夾心結構,從而催化氧化還原反應,導致電流的變化。Zhang等[40]采用雙抗夾心法對AFB1進行檢測,將BSA-AFB1固定在單層碳納米管/殼聚糖薄膜修飾的玻碳電極上,在最佳條件下檢測范圍為0.01～100 ng/mL,檢出限為0.0035 ng/mL。此傳感器已經被應用于玉米粉中AFB1的檢測,檢出限低至0.0135 ng/mL,遠遠低于國家的驗收標準。王瑞鑫等[41]將AFB1抗體物理包埋在殼聚糖-金溶膠(CS-GNPs)復合材料中,以K3[Fe(CN)6]為探針進行檢測,檢測范圍為0.1～1.1 ng/mL,檢出限為0.05 ng/mL。雖然該傳感器簡便、快速,但是物理吸附的AFB1抗體會在分析過程中發生脫落,導致傳感器的靈敏性和重現性降低。

1.2 阻抗型免疫傳感器

阻抗型免疫傳感器主要是通過檢測抗原抗體反應后引起的電子轉移阻抗的變化來檢測分析物,相比于其它免疫傳感器,阻抗型免疫傳感器一般不需要酶標記抗原或抗體,也無需使用二抗放大信號,大大簡化了傳感器的制備。Ma等[42]通過一步法在金微電極表面電沉積殼聚糖-AuNPs復合納米材料,將AFB1抗體共價固定在電極上后,結果顯示,AFB1抗體的固定以及抗原與抗體的結合增大了電子轉移電阻。該傳感器的檢測范圍為0.1～30 ng/mL,檢出限為0.06 ng/mL,此方法檢測時間較短,且一步法電沉積不僅大大簡化了傳感器的制備也制造更多的可控性和可重復性。Costa等[43]將AFB1抗體固定在多壁碳納米管修飾的金電極,基于抗原與抗體的特異性結合構建了一種免標記的傳感器,其檢測時間為15 min,檢測范圍為0.0001～0.02 ng/mL,檢出限為0.79 pg/mL。該傳感器不僅操作簡便,且靈敏度較高,為黃曲霉素的現場快速檢測分析提供了可能。Yu等[44]用多壁碳納米管/離子液體修飾玻碳電極,通過共價結合將AFB1的抗體固定在電極上,抗原抗體的結合阻礙了電子的轉移。該傳感器的檢測范圍在(0.1～10) ng/mL,檢出限達0.03 ng/mL,相比傳統的TLC或HPLC法,此方法成本低廉,且離子液體的修飾為抗體固定提供良好的微環境,大大提高了傳感器的穩定性和使用壽命。Owino等[45]通過直接吸附作用,將AFB1抗體固定在聚苯乙烯磺酸-聚苯胺修飾的鉑電極上,阻抗分析顯示抗體的固定阻礙了電子轉移。該傳感器的檢出限為0.1 ng/mL,且傳感器的穩定性比較好,但由于通過吸附作用固定抗體,抗體固定量少,傳感器特異性差,靈敏度低,難以滿足實際測定要求。

1.3 電勢型、電導型免疫傳感器

電導型免疫傳感器和電勢型免疫傳感器的最大區別在于測量方式的不同,電導型免疫傳感器通過測定電極間電導的變化從而確定待測物的濃度;而電勢型免疫傳感器通過測定工作電極和參比電極之間電流為零時的電勢變化與電化學反應中離子活性的關系來測量分析物[46]。由于電導型和電勢型傳感器選擇性較低,在實際中未得到廣泛的應用。Rameil等[47]在絲網印刷電極上電聚合聚吡咯,物理吸附多克隆抗體,構建了電勢型免疫傳感器,該傳感器的檢測范圍為0.25～2 ng/mL,檢出限為0.04 ng/mL。Liu等[48]在微梳狀電極上自組裝納米金、AFB1抗體和辣根過氧化物酶后,由于抗原與抗體發生特異性結合,導致溶液的電導發生改變,電導變化和溶液中AFB1的量存在線性關系,從而可以測得AFB1的濃度。該免疫傳感器檢測范圍為0.5～10 ng/mL,檢出限達0.1 ng/mL。雖然納米金的修飾,明顯提高了傳感器的靈敏度,但是,其在電極上的分布和尺寸難以控制,而且自組裝金粒層的機械穩定性差,勢必會影響傳感器的可重復性。

2 電化學核酸適體傳感器在黃曲霉毒素檢測中的應用

核酸適體是一段人工合成的能夠與目標分子(離子、蛋白質、毒素、核酸或整個細胞等)進行高親和性和高特異性結合的單鏈DNA或RNA[49]。與抗體相比,核酸適體具有體外制備簡便、易于修飾、選擇性高、穩定性好等優點[50],已廣泛應用于黃曲霉毒素的檢測當中。表2為目前研究者所篩選出關于黃曲霉毒素的適配體,表3為文獻報道的有關電化學適體傳感器在黃曲霉毒素的應用。

表3 電化學適體傳感器在黃曲霉毒素檢測中的應用Table 3 Application of electrochemical aptasensor inthe detection of aflatoxin

表2 黃曲霉毒素適配體序列Table 2 Aptamers of aflatoxin

2.1 電流型核酸適體傳感器

電流型核酸適體傳感器是在恒定電壓下,由于適配體與待測物質發生特異性結合引起電信號的變化,從而實現對目標物檢測的裝置。Goud等[53]用功能化的氧化石墨烯修飾絲網印刷電極,將亞甲基藍修飾的適配體固定在電極上,當待測液中不存在AFB1時,亞甲基藍遠離電極表面,產生弱的電化學信號,當待測液中存在AFB1時,其與適配體結合導致構象改變,亞甲基藍靠近電極表面,引起電流值發生變化。該方法的檢測范圍為0.05～6.0 ng/mL,檢出限為0.05 ng/mL。同樣對于AFB1的檢測,Yugender等[54]將適配體固定在氨基苯甲酸修飾的電極上,利用適配體對AFB1的特異識別進行檢測,其檢測范圍為0.125～16 ng/mL,檢出限達0.12 ng/m L,該方法操作簡便、成本低廉,且適用性在啤酒和葡萄酒樣品中已得到驗證。Abnous等[55]基于適配體開發了一種π型電化學傳感器,以Fe[(CN)6]3-/4-為指示劑,在沒有AFB1的情況下,π形結構的大部分是完整的,并且Fe[(CN)6]3-/4-遠離電極表面,產生微弱的電流信號,當待測物中有AFB1時,AFB1與適配體特異性結合,π形結構被破壞,釋放出互補鏈。核酸外切酶消化互補鏈,導致Fe[(CN)6]3-/4-更多地進入電極表面,并產生強電流信號。該傳感器的檢測范圍為0.007～5 μg/mL,檢出限達0.002 μg/mL,π形結構的使用顯著提高適體傳感器的靈敏度。Zheng等[56]采用端粒酶和核酸外切酶Ⅲ(EXO Ⅲ)雙重信號放大策略來提高檢測的靈敏度,一重放大用端粒酶來延長固定在納米金表面的DNA,使信號響應范圍擴大,二重放大用EXO Ⅲ可以水解適體識別AFB1后形成的3′,使AFB1釋放到檢測系統中,參與下一個識別檢測周期,進行信號放大。該傳感器的檢測范圍為0.6×10-4～100 ng/mL,檢出限為0.6×10-4ng/mL。這種基于異源酶的雙向信號放大電化學適體傳感器為其它真菌毒素的超靈敏檢測提供了理論參考。

2.2 其它電化學核酸適體傳感器

Evtugyn等[57]針對適體的固定過程,用電聚合的中性紅和環芳烴修飾玻碳電極,將AFB1的適配體共價固定在環芳香烴上,當溶液中存在目標物AFB1時,適配體與AFB1發生特異性的結合,由于表面位阻的原因,電荷轉移的電阻值增加,中性紅與電極表面之間電子交換能力減弱,進而導致電化學信號的變化,使用該方法可檢測的最低濃度為0.0561 ng/mL。基于同樣的原理,Dinckaya等[58]將巰基修飾的AFB1的適配體固定到半胱胺和納米金顆粒修飾的電極上,雖然該傳感器的檢測范圍只有1～14 ng/mL,但重現性好、靈敏度高。Castillo等[59]針對適體和目標物識別過程,將PAMAM G4樹狀大分子固定在半胱氨酸修飾的金電極上,通過戊二醛固化AFB1適配體,利用循環伏安法和電化學阻抗光譜法通過氧化還原反應指示劑Fe[(CN)6]3-/4-來采集電化學信號響應,該傳感器已經被應用于花生樣品的實際檢測當中,檢測范圍為0.4～10 nmol/L,檢出限為0.4 nmol/L。Karapetis等[60]采用同樣的方法來檢測牛奶中的AFM1,歐盟對牛奶中AFM1的限量標準為0.05 ng/mL,而在最佳實驗條件下,此方法的檢出限可達0.015 ng/mL。同樣是對于牛奶中的AFM1的檢測,Smolko等[61]將AFM1適配體固定在中性紅和羧酸鹽柱芳烴修飾的玻碳電極上,AFM1檢測范圍可達0.005～0.12 ng/mL,檢出限達0.0005 ng/mL,該方法操作簡單,靈敏度高,能夠與ELISA法相媲美。

3 電化學酶傳感器在黃曲霉毒素檢測中的應用

電化學酶傳感器是利用電化學裝置將酶反應所產生或者消耗的物質的量轉化成電信號的一種檢測裝置,是目前應用較廣、數量較多的一類生物傳感器。根據產生的電信號方式,電化學酶傳感器可以分為電位型和電流型,由于近幾年來,電位型酶傳感器在黃曲霉毒素檢測方面報道較少,文章按其作用原理主要分為兩類:一類是基于黃曲霉毒素對乙酰膽堿酯酶(AChE)的抑制作用;另一類是基于黃曲霉毒素氧化酶(AFO)對AFB1上雙呋喃結構不飽和碳鍵的催化作用。

Rejeb等[62]通過交聯作用將膽堿氧化酶(choline oxidase,Chox)固定到普魯士藍修飾的絲網印刷電極表面上,構建了一種基于AChE和膽堿氧化酶的雙酶傳感器,該傳感器的檢測范圍為10～60 ng/mL,樣本經濃縮后,檢出限達2 ng/mL。劉曉偉等[63]將炭氣凝膠與AChE混合后固定到硼摻雜金剛石電極表面,AFB1能抑制AChE的催化活性,使底物生成的膽堿減少,進而導致氧化電流的降低,用循環伏安法和差分脈沖伏安法檢測溶液中的AFB1,檢出限為0.89 μg/mL。Li等[64]利用AFO對AFB1的催化作用,在多層碳納米管上固定AFO,當AFB1存在時,AFO作用于AFB1分子雙呋喃結構上的不飽和碳鍵生成O2和H2O2。該傳感器的檢出限為1.6 nmol/L。Liu等[65]將AFO固定在多壁碳納米管上,用來檢測AFB1,當把黃曲霉毒素氧化還原酶和AFB1抗體通過多壁碳納米管共固定化制作修飾電極,傳感器的靈敏度提高了10倍。該傳感器的靈敏性、穩定性和重現性都較好。

4 結論與展望

近年來,隨著科學技術的不斷進步,電化學生物傳感技術也得到了快速的發展,并在實際樣品的檢測中呈現出良好的檢測效果。本文綜述了免疫傳感器、核酸適體傳感器、酶傳感器在黃曲霉毒素中的應用及研究進展,筆者認為,基于目前電化學生物傳感器所存在的缺陷,未來的改進方向主要集中在以下幾個方面:一：在黃曲霉毒素的檢測中實際樣品的預處理會影響傳感器的靈敏度,但是對于固體樣品的免疫親和柱凈化方法等經典的樣品預處理方法操作復雜、耗時、重現性差,已成為分析檢測的瓶頸之一。而使用表面修飾有抗體或核酸適體的磁親和固相萃取吸附劑,可以從復雜樣品中選擇性的提取待測物質[66],有望提高預處理樣品精度,進而提高傳感器的靈敏度。二：在電化學傳感器中識別元件通常只能夠識別一到兩種毒素分子,而實際生產中需要對多種毒素進行同時檢測。例如,使用96孔絲網印刷微板或8個絲網印刷組成的傳感器陣列,在陣列的不同行或不同列固定不同分析物的抗體,實現毒素的高通量檢測,從而節省分析時間、降低分析成本。三：實際檢測中對痕量及超痕量目標分子檢測的要求使得科研工作者致力于提高傳感器靈敏度的研究。納米材料比表面積大、生物相容性好、電催化性能好、穩定性高,可以大大提高傳感器的靈敏度和壽命。例如,碳納米管、石墨烯、金納米顆粒等納米材料對于信號放大發揮了尤為明顯的作用。因此,擴大納米材料的選用范圍,并將納米技術、酶催化技術、生物放大等技術聯合應用,有望為電化學生物傳感器開拓新的領域。四：在電化學免疫傳感器中抗體的制備周期長、價格高、易失活,且抗原與抗體容易出現交叉反應。使用分子印跡技術制備的與毒素特異性結合的分子印跡聚合物(molecular imprinted polymer,MIP)不僅特異性好、成本低廉、耐高溫、耐酸堿,還可重復使用。若在電化學的基礎上聯合使用分子印跡技術不但可以降低分析成本,而且能大大提高傳感器的特異性。

隨著現代技術的不斷發展,科學家將開發越來越多的電化學生物傳感器,黃曲霉毒素電化學傳感器的靈敏性、穩定性、特異性、重現性也將得到提高,價格低廉、微型化、自動化、便于攜帶、便于檢測的新型電化學生物傳感器將廣泛應用于食品中真菌毒素的檢測。

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