復合益生菌液態發酵黃芪的制備方法

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(1.河南牧業經濟學院，河南 鄭州 450046; 2.鄭州市益生菌發酵中藥重點實驗室，河南 鄭州 450046;3.河南省益生菌生物轉化工程技術研究中心，河南 鄭州 450046; 4.河南省微生物生物轉化中藥工程實驗室，河南 鄭州 450046; 5.鄭州市質量技術監督檢驗測試中心，河南 鄭州 450007)

中草藥是目前公認的綠色飼料添加劑，其在增強動物機體免疫力、抗菌、抗病毒等方面具有良好的作用效果[1-2]。但是中草藥在臨床應用中也存在一定缺點，如添加量較大、適口性較差、成本較高等，對其在動物生產上的推廣與應用產生了不利的影響。常作為飼料添加劑的益生菌如枯草芽孢桿菌、乳酸菌等，具有增強動物機體免疫力、調整腸道菌群平衡、維持腸黏膜完整性及提高腸道消化吸收功能的作用[3-4]。結合現代微生物發酵工程技術，利用益生菌對中草藥進行生物轉化是對中草藥炮制方法的創新，該技術能提高中草藥的臨床應用效果，主要表現在減少用藥劑量、提高有效成分作用速率以及具有多功能性等，并且能降低某些藥物的毒副作用[5]。一方面，中草藥黃芪在提高動物機體免疫力、抗應激和抗氧化能力方面具有良好的作用效果，并且對枯草芽孢桿菌和乳酸菌等益生菌的體外增殖具有良好的促進作用；另一方面，黃芪經益生菌發酵后臨床效果得到加強，用量減小的同時，提高了臨床應用價值[6-7]。目前，關于發酵黃芪制劑的開發研究，主要集中于利用1種或1類益生菌對黃芪進行生物轉化，多菌種混合發酵研究較少。本研究利用枯草芽孢桿菌、酵母菌和乳酸菌對黃芪進行分段復合發酵，旨在增強益生菌對黃芪生物轉化的效果，發揮多菌種協同作用，加強復合益生菌黃芪發酵制劑的多功能特性，提高其臨床應用效果。

1 材料和方法

1.1 試驗材料及主要儀器

試驗用黃芪飲片購于亳州藥材市場；枯草芽孢桿菌、酵母菌和乳酸菌菌種由河南牧業經濟學院發酵中藥實驗室保存；營養瓊脂培養基、莫匹羅星鋰鹽MRS培養基均購于北京澳博星生物技術有限公司；馬鈴薯液體、瓊脂培養基(含氯霉素)均購于青島高科技工業園海博生物技術有限公司；恒溫培養箱購于寧波萊福科技有限公司；恒溫搖床購于天津路業實驗儀器公司；電子天平購于鄭州通渠商貿有限公司；200 L全自動發酵罐購于鎮江東方生物工程設備技術公司。

1.2 菌種活化

將枯草芽孢桿菌、酵母菌及乳酸菌菌種的甘油凍存管置于室溫，融化后用無菌接種環挑取少量菌種分別劃線接種于營養瓊脂培養基、馬鈴薯瓊脂(含氯霉素)培養基和莫匹羅星鋰鹽MRS瓊脂培養基，分別在37、28、37 ℃倒置培養24 h，然后將其轉接至相應液體培養基，適宜條件下培養24 h后備用。

1.3 黃芪提取液的制備

準確稱取適量的黃芪飲片，分別加5、4、4倍量的水，煮沸3次，每次約40 min，分別留取每次濾液，最后合并3次濾液并濃縮至黃芪質量濃度為0.5 g/mL，保存備用。

1.4 黃芪添加量、發酵培養基及發酵條件

黃芪提取液的添加量為：每毫升培養基中含黃芪0.5 g。發酵培養基組成為：每100 mL培養基中含黃芪50.0 g、豆粕2.0 g、玉米2.0 g、麩皮2.5 g；培養基初始pH值均為8.00，裝液量均為100 mL(500 mL三角瓶)[8]。枯草芽孢桿菌、酵母菌和乳酸菌發酵溫度分別為37、28、37 ℃，乳酸菌靜置培養，枯草芽孢桿菌和酵母菌置恒溫搖床轉速160 r/min培養。

1.5 復合菌種分段發酵黃芪條件測定

1.5.1 菌種接種順序對菌體生長的影響 取制備好的培養基18瓶，隨機分為1—6組，每組3個重復，每個重復3瓶。按表1所示順序組合將菌種分別在一定的時間點按1.0%的接種量接種至培養基中，接種后培養時間均為24 h，培養結束后鏡檢各菌種的生長情況及pH值，接種的相應菌種生長用“√”表示，接種的相應菌種未生長用“-”表示。

表1 菌種接種順序 Tab.1 The inoculation order of strains

1.5.2 枯草芽孢桿菌發酵時間對酵母菌生長的影響 采用單因子試驗法，取制備好的培養基15瓶，隨機分為1—5組，每組3個重復，每個重復3瓶。1—5組均按3.0%接種量接入枯草芽孢桿菌[9]，分別在接種后的24、36、48、60、72 h，取樣測定枯草芽孢桿菌數量，同時各組均按1.0%接種量接入酵母菌，培養24 h后測定酵母菌數量。

1.5.3 酵母菌最適接種量的測定 采用單因子試驗法，取制備好的培養基15瓶，隨機分為1—5組，每組3個重復，每個重復3瓶。1—5組均按3.0%接種量接入枯草芽孢桿菌，按1.5.2中所得最優培養時間進行培養后，各組分別按0.1%、0.5%、1.0%、2.0%、4.0%的接種量接入酵母菌，培養24 h后測定酵母菌的數量。

1.5.4 酵母菌發酵時間對乳酸菌生長的影響 采用單因子試驗法，取制備好的培養基15瓶，隨機分為1—5組，每組3個重復，每個重復3瓶。1—5組均按3.0%的接種量接入枯草芽孢桿菌，按照1.5.2中所得最優培養時間進行培養，然后均按1.5.3中所得最佳接種量接入酵母菌，分別在接種后的24、36、48、60、72 h，取樣并測定酵母菌數量，同時各組均按1.0%的接種量接入乳酸菌，培養24 h后測定乳酸菌數量。

1.5.5 乳酸菌最適接種量的測定 采用單因子試驗法，取制備好的培養基15瓶，隨機分為1—5組，每組3個重復，每個重復3瓶。1—5組均按3.0%的接種量接入枯草芽孢桿菌，按照1.5.2中所得最優培養時間進行培養，然后均按1.5.3中所得最佳接種量接入酵母菌，再按照1.5.4中所得最優培養時間進行培養后，各組分別按0.1%、0.5%、1.0%、2.0%、4.0%的接種量接入乳酸菌，培養24 h后測定乳酸菌的數量。

1.5.6 發酵時間對乳酸菌生長的影響 采用單因子試驗法，取制備好的培養基15瓶，隨機分為1—5組，每組3個重復，每個重復3瓶。1—5組均按3.0%的接種量接入枯草芽孢桿菌，按照1.5.2中所得最優培養時間進行培養，然后均按1.5.3中所得最佳接種量接入酵母菌，再按照1.5.4中所得最優培養時間進行培養，最后各組均按1.5.5中所得最佳接種量接入乳酸菌，分別在培養24、36、48、60、72 h時，取樣并測定乳酸菌數量。

1.6 中試擴大試驗

為進一步確定上述搖瓶試驗結果的實用性，利用200 L全自動不銹鋼發酵罐及篩選后的培養基進行中試擴大試驗，并檢測發酵液各菌種的數量和發酵終點pH值。培養基初始pH值為8.00，裝液量為70%；枯草芽孢桿菌發酵溫度為37 ℃，接種量為3.0%，電機轉速為250 r/min，通氣量為0.05 m3/min；酵母菌發酵溫度為28 ℃，電機轉速為250 r/min，通氣量為0.05 m3/min；其他發酵條件按照1.5中所得的最優結果執行。

1.7 活菌數量的測定

采用平板菌落計數法測定活菌數量[10]。取1 mL發酵好的菌液稀釋至10-6、10-7、10-8倍，取1 mL稀釋液于無菌平板，然后加入適量瓊脂培養基搖勻，待培養基凝固后，在適宜溫度下倒置培養24 h，查出平板菌落數，測數樣品設3個重復。根據公式：每毫升活菌數=平板上菌落數×稀釋倍數，來計算發酵液中活菌總量。

枯草芽孢桿菌活菌數量的測定為：將發酵液置于80 ℃水浴鍋中20 min，此后操作同平板菌落計數法，測數培養基采用營養瓊脂培養基，培養條件為37 ℃有氧培養；酵母菌測定采用馬鈴薯瓊脂培養基(含氯霉素)，培養條件為28 ℃有氧培養；乳酸菌測數培養基采用莫匹羅星鋰鹽MRS瓊脂培養基，培養條件為37 ℃厭氧培養。

2 結果與分析

2.1 菌種接種順序對菌體生長的影響

由表2所示，按1、2組的菌種接種順序，3種益生菌均能正常生長，按其他4組接種順序，枯草芽孢桿菌不能生長。試驗開始，按照表1的接種順序，各組分別接種枯草芽孢桿菌(1、2組)、酵母菌(3、4組)和乳酸菌(5、6組)，培養24 h后，各組中菌體均能生長。pH值以枯草芽孢桿菌組最高，分別為5.85和5.84；酵母菌組次之，pH值均為5.63；乳酸菌組最低，pH值分別為4.08和4.09。各組在24 h時分別接入相應菌種(表1)，培養24 h后，1、5組(酵母菌)和2、4組(乳酸菌)接入的菌種均能正常生長，以上各組pH值分別為4.75、3.96、4.14、4.75；3、6組(枯草芽孢桿菌)接入的菌種未生長，pH值分別為5.32和4.02。各組在48 h時接入相應菌種(表1)，培養24 h后，4、5組(枯草芽孢桿菌)未生長，其他各組接種的菌種正常生長，終末菌液均呈酸性，pH值分別為4.73、4.03、4.82、4.83、3.92、3.99，乳酸菌接種順序在酵母菌之前組別(2、5、6組)的pH值低于酵母菌接種順序在乳酸菌之前的組別(1、3、4組)。由于枯草芽孢桿菌和酵母菌均為需氧菌，除溫度之外其他發酵條件一致，第1組的接種順序在制劑制備時操作方便，因此確定第1組為最佳接種順序組合。

表2 菌種接種順序對菌體生長的影響Tab.2 Effect of inoculation sequence on growth of strains

注：“√”表示接種的菌種生長，“-”表示接種的菌種未生長。

Note：“√” indicates the growth of the inoculated strain,and “-” indicates that the inoculated strain did not grow.

2.2 復合菌種分段發酵黃芪條件對各菌種生長的影響

2.2.1 枯草芽孢桿菌發酵時間對酵母菌生長的影響 由表3所示，檢測得枯草芽孢桿菌在后續試驗過程中活菌數量變化較小；當枯草芽孢桿菌培養時間為24 h時，接種的酵母菌在培養后獲得的數量最高，為0.98×108cfu/mL，另外4組酵母菌數量在0.75×108～0.91×108cfu/mL，隨著枯草芽孢桿菌培養時間的延長酵母菌數量呈下降趨勢，說明延長枯草芽孢桿菌的培養時間能抑制酵母菌的生長。結果表明，在枯草芽孢桿菌培養24 h時接種酵母菌，既能保證枯草芽孢桿菌得到充分的生長，又能使酵母菌的菌體數量較高，因此，確定枯草芽孢桿菌培養24 h時為酵母菌的最優接種時間。

表3 枯草芽孢桿菌培養時間對酵母菌生長的影響Tab.3 Effect of Bacillus subtilis culture time on the growth of yeast

2.2.2 接種量對酵母菌生長的影響 由表4所示，隨著酵母菌接種量的提高，培養后所得酵母菌數量先升高后降低，以接種量為2.0%的試驗組酵母菌數量最高，為1.34×108cfu/mL，因此，確定酵母菌最佳接種量為2.0%。

表4 接種量對酵母菌生長的影響Tab.4 Effect of inoculating volume on the growth of yeast

2.2.3 酵母菌培養時間對乳酸菌生長的影響 由表5所示，酵母菌數量隨著培養時間的延長，活菌數量先升高后降低，以培養時間為60 h時的活菌數量最高，為1.98×108cfu/mL；隨著酵母菌培養時間的延長，后續接種并培養的乳酸菌數量先升高后降低，當酵母菌培養時間為48 h時，接種的乳酸菌培養后獲得的數量最高，為12.22×108cfu/mL。酵母菌培養48 h時乳酸菌數量為1.87×108cfu/mL，雖然低于酵母菌培養60 h時的乳酸菌數量，但考慮到此時接種所得乳酸菌的活菌數最高，且延長培養時間增加能耗，因此，確定酵母菌培養48 h時為乳酸菌的最優接種時間。

表5 酵母菌培養時間對乳酸菌生長的影響Tab.5 Effect of yeast culture time on Lactobacillus growth

2.2.4 接種量對乳酸菌生長的影響 由表6所示，隨著乳酸菌接種量的提高，培養后所得乳酸菌數量先升高后降低，以接種量為0.5%的試驗組乳酸菌數量最高，為11.48×108cfu/mL，因此，確定乳酸菌的最佳接種量為0.5%。

表6 接種量對乳酸菌生長的影響Tab.6 Effect of inoculating volume on the growth of Lactobacillus

2.2.5 培養時間對乳酸菌生長的影響 由表7所示，隨著培養時間的延長，乳酸菌數量呈降低趨勢，以培養時間為24 h的乳酸菌數量最高，為11.64×108cfu/mL，因此，確定乳酸菌最優培養時間為24 h。

表7 培養時間對乳酸菌生長的影響Tab.7 Effect of culture time on the growth of Lactobacillus

2.3 中試擴大試驗結果

由表8所示，按上述試驗所得最優發酵條件，調整培養基初始pH值為8.00，發酵罐裝液量為70%，枯草芽孢桿菌接種量為3.0%，發酵溫度為37 ℃，電機轉速為250 r/min，通氣量為0.05 m3/min；枯草芽孢桿菌培養24 h后，以2.0%的接種量接種酵母菌，電機轉速為250 r/min，通氣量為0.05 m3/min，于28 ℃培養48 h；然后，以0.5%的接種量接種乳酸菌，于37 ℃靜置培養24 h。檢測發酵液中各菌種的數量如下：枯草芽孢桿菌為28.52×108cfu/mL，酵母菌為5.71×108cfu/mL，乳酸菌為9.34×108cfu/mL，終末pH值為4.55。與前期搖瓶試驗階段相比，乳酸菌數有所降低，但枯草芽孢桿菌和酵母菌數量大幅提高，說明本研究利用復合益生菌液態發酵黃芪的方法具有良好的可行性。

表8 中試擴大試驗結果Tab.8 Result of pilot test

3 結論與討論

本研究表明，利用多菌種能對黃芪提取液進行混合發酵，接種順序為枯草芽孢桿菌、酵母菌、乳酸菌；最優發酵條件為：枯草芽孢桿菌以3.0%的接種量于37 ℃培養24 h后，以2.0%的接種量接種酵母菌，于28 ℃培養48 h后，再以0.5%的接種量接種乳酸菌，于37 ℃靜置培養24 h；按優化后的發酵條件，利用發酵罐進行中試試驗，發酵結束時，枯草芽孢桿菌、酵母菌、乳酸菌的活菌數分別為28.52×108、5.71×108、9.34×108cfu/mL，終末pH值為4.55。黃芪經益生菌混合發酵后，其作用效果與發酵之前或單一菌種發酵相比是否會有所提高，還需進一步研究。

3.1 分段復合發酵中菌種接種順序對各菌種生長的影響

目前，關于多菌種復合發酵制備飼料添加劑或發酵型飼料原料的研究主要集中在利用同類菌種的混合發酵，由于同類菌種生長繁殖條件相似，混合發酵培養可行性強，通過同類多菌種混合發酵能有效提高發酵液中活菌數量或發酵底物的品質。例如，王玉燕等[11]利用3株乳酸菌混合發酵制備具有高活菌含量的發酵液，通過發酵條件和培養基的優化，活菌數量可達到1.8×1013cfu/mL。利用不同種類的有益菌混合發酵亦有報道，李祖旭[12]用枯草芽孢桿菌、米曲霉、鼠李糖乳桿菌和長雙歧桿菌發酵健胃消食片藥渣得到的制劑，對脾虛小鼠腸道菌群具有一定的調節作用；王國強等[13]利用異常漢遜酵母菌、枯草芽孢桿菌、干酪乳桿菌,以2∶2∶1的比例，5%的接種量，發酵豆粕48 h，明顯提高了豆粕的營養價值。由于不同種類的菌種發酵條件和營養需求不一致，如果在相同的發酵條件下，將不同種類的菌種同時接種至同一培養基中，再加上菌種在生長過程中可能產生相互抑制，將會導致某些菌種生長不充分甚至無法生長。肖萌[13]利用納豆芽孢桿菌和乳酸菌分段接種的方法混合發酵菜籽粕，首先接種納豆芽孢桿菌，2 d后再接種短乳桿菌，再發酵2 d，通過成分檢測發現，菜籽粕經發酵后粗蛋白、粗脂肪及總氨基酸等含量顯著升高，植酸和單寧含量顯著降低，整體營養價值得到提升。

本研究選用營養成分復雜的玉米、麩皮和豆粕混合物作為發酵黃芪提取液的培養基原料，能減少因營養需求不同對菌種生長造成的不利影響。接種方式采用分段接種，能夠避免因發酵條件不同導致的菌體生長受阻，例如枯草芽孢桿菌和酵母菌在有氧條件下能大量繁殖，而乳酸菌則要求微需氧或厭氧條件。因此，接種順序直接決定了黃芪發酵液中益生菌的種類和數量。試驗中1、2組首先接種枯草芽孢桿菌，培養結束時pH值接近6.00，后續按不同順序接種酵母菌和乳酸菌均能生長；3—6組首先接種酵母菌或乳酸菌，培養結束時pH值大約在4.00～5.50，后續培養枯草芽孢桿菌均不能正常繁殖，與史洪濤[14]研究結果相一致，推測培養基呈酸性可能是枯草芽孢桿菌不能正常繁殖的主要原因之一。此外，各菌種的代謝產物是否對其他菌種的生長產生抑制或促進作用，還有待深入研究。

3.2 復合菌種分段發酵條件對各菌種生長的影響

發酵條件是影響發酵產品品質的重要因素，相關研究表明，適宜的發酵條件包括發酵溫度、接種量、接種順序、pH值、含水量(固態發酵)等，能提高發酵產物中菌體數量，有利于目標代謝產物的積累，并且能降低發酵底物中有害物質的含量，進而提高發酵制劑品質和臨床應用效果[15-19]。本研究將發酵菌種按一定的順序接種至含有黃芪提取液的培養基中，由于微生物之間的相互作用關系比較復雜，混合培養能造成菌種之間的空間和營養競爭，一方面能提高營養物質的利用率，另一方面也可能造成不同菌種之間在生長繁殖方面的協同或拮抗作用。在搖瓶試驗階段，枯草芽孢桿菌和酵母菌受到供氧條件的限制，但在中試擴大試驗時，獲得充足氧氣的枯草芽孢桿菌和酵母菌，在培養后活菌數量大幅提升。由此推斷，由枯草芽孢桿菌和酵母菌活菌數量的增加所產生的營養競爭或菌體之間的抑制作用，可能是降低乳酸菌數量的原因。不同菌種之間產酶具有互補性，某些中藥大分子或前體成分經微生物酶系轉化后生成次級代謝產物具有更強的生物活性[20]，因此，在保證各菌種能夠生長的情況下，通過調整不同菌種的發酵時間和接種量，降低菌種之間因生長拮抗產生的不利影響，提高每個種類菌體的數量，能使復合菌種發酵的酶系更有利于黃芪成分的生物轉化。