鼠疫歷史疫情的考古微生物學研究進展

宋凱 祁芝珍 楊瑞馥 宋亞軍

鼠疫是由鼠疫耶爾森氏菌（簡稱鼠疫菌）引發的一種自然疫源性疾病。鼠疫作為一種發病急、傳播快、病死率高、傳染性強的烈性傳染病，在人類歷史上曾發生過3 次世界性大流行：第一次大流行始于公元541—544年的古羅馬帝國，一直持續到公元767年，史稱查士丁尼瘟疫。該流行起源于亞洲中部，經地中海沿岸蔓延到北非、歐洲大陸乃至不列顛群島，累計造成1 億人死亡。暴發于公元1347年的第2次鼠疫大流行（史稱黑死病）同樣起源于亞洲，經古代絲綢之路抵達歐洲的地中海港口，波及亞洲、歐洲大部及非洲北部，并伴隨著周期性暴發持續到18 世紀。第3 次鼠疫大流行起始于19 世紀50年代的中國云南，隨后于1894年經香港傳播到全球。微生物學家 Alexandre Yersin 于1894年在香港患者體內分離得到鼠疫菌，進而確認了鼠疫菌是引發現代鼠疫大流行的罪魁禍首。而由于前兩次鼠疫大流行在臨床癥狀、傳播速率及死亡率等方面與第3 次存在一些差異，關于其病原體是否為鼠疫菌的問題曾一度處于爭論之中；近來，隨著考古微生物學（Paleomicrobiology）的發展，這一爭論已基本得到解決。

考古微生物學最早可追溯到19世紀20年代，旨在通過研究古人體或古環境樣本中的病原體信息來建立古代傳染病的診斷體系，并結合相關歷史記錄，以更好地闡釋古代病原體的進化、毒力狀態、疫源地、傳播媒介、傳播路線等問題。支撐該領域的原理是，尸骸內特定組織能夠保存導致個體死亡的病原體的DNA 或蛋白質等生物大分子。盡管特定環境下古DNA 能夠長期保存，但水解作用及化學損傷等導致的DNA 降解仍是考古微生物學面臨的主要挑戰。此外，由于實驗過程中可能會出現當前生物分子的污染，嚴格無菌操作和實驗對照便成為考古微生物學這一領域發展的必要基礎。迄今為止，已從很多考古樣本中分離得到古微生物DNA，包括凍土、琥珀、骨骼、內臟器官、牙髓和糞化石等。考古微生物學研究方法主要包括顯微觀察、免疫檢測、PCR 測序和系統發育分析等。其中，基于古DNA 的系統發育分析能夠確定病原體基因組的變異情況，揭示其可能的進化過程，進而闡明傳染病的擴散路徑；鼠疫歷史疫情的相關研究是考古微生物學研究中一個比較成功的范例。

1 基于PCR 的古DNA 檢測

由于鼠疫會導致菌血癥，而牙髓是牙齒中高度血管化的軟組織，加之牙齒良好的封閉環境，使得古代病原體DNA 在牙齒中的長期保存成為可能。1998年，Drancourt 等以牙髓為檢測樣本，以鼠疫菌特異性基因pla為靶基因，對法國普羅旺斯地區兩處萬人冢出土的疑似鼠疫患者殘骸進行核酸檢測。在獲得的12顆牙齒中，有6 顆檢測到pla特異性片段，且DNA 序列與現代鼠疫pla序列一致；用于擴增ropB片段的4 顆牙齒，在經過兩輪PCR 后，獲得預期片段；而用作陰性對照的7顆牙齒全部未檢出鼠疫菌。這一研究首次從實驗室診斷的角度確定，1722年馬賽大瘟疫（黑死病）的病原體是鼠疫菌，并建立了基于核酸分子鑒定對古代鼠疫進行檢測的方法，成為后續工作的借鑒。

樣本污染是古DNA 檢測最需要注意的問題之一，為解決這一風險，研究人員設計了“自殺PCR”的檢測方案，陸續確認了鼠疫菌是歐洲黑死病及查士丁尼大瘟疫的罪魁禍首。在隨后的研究中，基于核酸檢測的新方法不斷應用于古代鼠疫菌的檢測鑒定，包括基因間區分型系統、簡單的系統發育分析以及16S rRNA 序列測定等，在很大程度上推動了古代鼠疫的實驗室診斷及鼠疫菌的分子鑒定工作，使之前僅僅基于人類學數據或歷史文獻記載的鼠疫病因學推測得以證實。

2 古代鼠疫菌的蛋白質檢測

研究表明，蛋白質在某些考古樣本中能保存更長時間，因此對鼠疫菌特異性蛋白質的檢測可作為古代鼠疫檢測方法的補充。F1 蛋白是鼠疫菌產生的一種特異性莢膜抗原，也是鼠疫實驗室診斷中必不可少的靶標。鼠疫菌存活與否、樣本存留時間等一般不會影響F1 抗原的檢測結果，這也為古代鼠疫菌的免疫檢測提供了可能。Pusch 等人于2004年首次通過免疫層析試紙，在德國一處教堂埋葬的17 世紀的骨骼殘骸中檢測到鼠疫菌F1 抗原。在此研究中，研究人員根據埋葬的尸體是否經過石灰消毒處理來初步判斷是否死于鼠疫，隨后分別選取死于黑死病和正常死亡的各12 具尸骸作為樣本，采用DNA 雜交及免疫層析兩種方法同時進行檢測。結果顯示，在死于黑死病的12 具尸骸中，通過特異性擴增caf1基因片段，僅有2個樣本得到陽性結果，而通過免疫層析方法可檢測到10 個樣本呈陽性，說明F1 抗原蛋白相較于其編碼基因caf1 的保存更加持久和完整。該研究表明，古代鼠疫患者遺骸中F1 抗原含量足夠用于檢測鑒定，這為古代鼠疫的抗原檢測奠定了基礎。此后，研究人員不斷改良古代鼠疫菌的F1 抗原檢測方法，包括快速檢測試紙試驗（RDT）、iPCR 等技術，大大提高了古代鼠疫菌F1 抗原檢測的靈敏度。

除單一 F1 抗原檢測外，Drancourt 等還將蛋白質組學技術應用于18 世紀的鼠疫遺骸的分析。該研究將牙髓蛋白提取純化后，通過質譜分析發現，在鑒定的211 個細菌源性多肽中有4 個多肽分屬于3個耶爾森氏菌屬蛋白，其中的一個多肽僅與假結核耶爾森氏菌和鼠疫菌完全匹配。此外他們還發現，古遺體牙髓中可以檢測到免疫球蛋白，提示考古遺骸牙髓的蛋白質組學也可用于研究病原和宿主炎癥反應，使得古代疾病的血清學檢測成為可能。Righetti 等開發了一種EVAfilm（乙烯-乙酸乙烯酯共聚物 膠膜）技術應用于1630年意大利鼠疫考古材料的宏蛋白質組學分析，確認檢測得到的17 種耶爾森氏菌屬蛋白質是由鼠疫菌產生的。基于古蛋白質組學技術分析考古鼠疫相關樣本，可以通過多個鼠疫菌蛋白對古代鼠疫樣本進行更為全面的檢測和確認，提高樣本檢出率和結果可靠性。

3 古代鼠疫菌的基因組DNA分析

基因組學分析，不僅可以檢測古代樣本中是否存在鼠疫菌核酸，還可基于全基因組序列信息，回答古代鼠疫菌進化、毒力因子獲得或缺失以及鼠疫傳播擴散等更為復雜的問題。

2010年Bramanti 等通過部分基因組分析，將檢測到的黑死病菌株在鼠疫菌的系統發育樹上進行定位。2011年，Bos 等基于鼠疫菌CO92 株基因組設計芯片，富集黑死病遺骸牙髓中的鼠疫菌DNA，完成了第一株古代鼠疫菌基因組草圖測定。系統發育分析表明，該菌株是大部分現存鼠疫菌株的祖先，同時確認對人類致病的當代鼠疫菌很可能起源于中世紀時期。但該菌株與現代鼠疫菌基因組相比，未發現獨特的SNP位點，從遺傳學上難以解釋黑死病的高致死率，還需要結合其他諸多因素進行深入研究。Bos 等人此后又測定了5 株馬賽大鼠疫時期的鼠疫菌基因組，確認該時期的鼠疫菌是14 世紀黑死病菌株的后代，但該譜系在任何現存鼠疫疫源地都沒有發現。基于以上研究，Bos 等推測引發黑死病的鼠疫菌株的后代在某種未知的宿主體內潛伏數百年，產生了多樣化并最終導致18 世紀中期的馬賽鼠疫大流行。關于第二次鼠疫大流行為何能夠在歐洲持續數個世紀之久的爭論，主要存在兩種觀點：一種是認為黑死病時期的鼠疫是單一菌株的傳播導致，該菌株長期在歐洲潛伏并引發流行性鼠疫；另一種觀點則認為第二次鼠疫大流行是亞洲鼠疫多次向歐洲傳播的結果。但目前缺乏決定性證據證實任一假設，仍需要更多古代鼠疫菌基因組測定分析。

2014年，Wagner 等測定了德國墓葬得到的兩株查士丁尼鼠疫時期的鼠疫菌基因組，根據其在鼠疫菌系統發育樹的位置，認為導致前兩次鼠疫大流行的菌株都是早期中亞譜系的后代，同時是一些中國菌株的祖先，并推測導致查士丁尼鼠疫的菌株在第2 次大流行前已經滅絕。關于查士丁尼鼠疫起源及傳播路線問題，Wagner 提出該譜系起源于中國，經絲綢之路等貿易路線傳播至整個歐亞大陸，而第2 次大流行從亞洲傳播到歐洲后，又沿尼羅河傳播到中非地區。

經蚤傳播的能力是鼠疫菌毒力研究中的一個關鍵問題，而鼠疫菌歷史菌株基因組的測定為相關毒力因子的獲得缺失研究提供了依據。Rasmussen 等測定了7 株青銅時代的鼠疫菌基因組，發現該時期菌株缺少引發腺鼠疫的必要點突變（Pla的Ile259Thr 突變）。2017年，古人類學家Krause 等又測定了6 株新石器時代晚期至青銅時代（3700 至4800年前）歐洲鼠疫菌株（LNBA 譜系）的基因組，發現LNBA 菌株已具備在其祖先假結核耶爾森氏菌中不存在的pla和caf1 毒力基因，但缺失了在蚤傳播途徑中起重要作用的鼠毒素基因ymt，而且ureD基因（編碼脲酶D 蛋白，對蚤致死，失活后使鼠疫菌獲得經蚤傳播能力）能夠正常表達，這表明跳蚤很可能不是當時鼠疫傳播的主要媒介，支持了該時期鼠疫菌缺乏腺鼠疫感染模式的理論。值得一提的是，LNBA 譜系是目前已知最古老的鼠疫菌；這一研究將鼠疫菌的物種形成時間定位在5000～7500年前，是目前最為精確的鼠疫菌起源時間估算。2018年，Spyrou 等測定了兩株分離自俄羅斯的與LNBA 譜系同時期的鼠疫菌基因組，但該譜系在系統發育樹中形成一個獨立的分支，并且已具備經蚤傳播的關鍵基因，說明其已能夠適應跳蚤這一傳播媒介。此外，該譜系在系統發育樹上與0.PE4（田鼠型鼠疫菌）雖然位置相近，但致病性卻存在顯著差異，后續研究可以通過基因組的差異分析來探究二者毒力的差異原因。

4 小結

據WHO 報導，自2017年8月馬達加斯加鼠疫暴發后僅4 個月時間，已確認鼠疫病例2417 例，且超過100 人死亡。可以預見，馬達加斯加以及其他一些鼠疫疫源地仍會暴發疫情，將對世界醫療和公共衛生界構成極大的挑戰。因此，對鼠疫菌的進化路線、毒力變化及致病機制的研究仍是至關重要的。無論是從核酸或蛋白質方面，考古微生物學都將為以上研究提供一個嶄新的視角，使我們通過分析歷史上鼠疫疫情流行情況及鼠疫菌遺傳特征，進而探究其傳播方式及致病機制。然而，由于歷史不可重現，研究人員只能通過歷史記載及考古微生物學研究間接地推測古代鼠疫流行的場景；而考古微生物學研究樣本中的核酸和蛋白質都是痕量的，這一固有的局限性勢必導致爭議性結果的存在。在接下來的研究中，可以現有研究為基礎，在繼續探索新的古代鼠疫菌株基因組信息的基礎上，參考同時期流行地域的歷史人文資料，獲得更為可靠的結果。

考古微生物學在鼠疫歷史疫情研究中的成功實踐表明，這一新興學科將考古學、人類學、古地理學、古生態學與微生物學數據相結合進行整體研究，為更加全面、準確地解釋古代傳染病的起源、傳播及病原體進化等問題提供新的思路。〓