尾礦區砷污染土壤的植物、微生物協同修復

李秀玲，韋巖松，辛 磊，高宇星，韋詩琪，覃擁靈

(河池學院 化學與生物工程學院，廣西 宜州 546300)

污染土壤的重金屬主要是鎘、鎳、銅、砷、汞、鉛[1]。砷是一種有毒且致癌的化學元素，分布非常廣泛，土壤中的砷主要來源于農業和工業[2-5]。砷在土壤中具有隱蔽性、累積性、不可逆性和長期性等特點[6-7]，土壤的砷污染修復十分必要。

以往對砷污染土壤的處理方法是改變耕作方式、水洗土壤或添加拮抗劑、改良劑等[6]。這些方法雖有一定作用，但存在二次污染隱患，且工程量大，耗時費力，難以從根本上消除砷的危害[8-9]。生態修復技術克服了以上缺陷，已成為研究熱點和難點[10]。植物-微生物協同修復技術是目前最有發展潛力的一種生物修復技術[11]，可充分發揮植物與微生物的各自優勢，取長補短，提高污染土壤修復效率，杜絕二次污染[12]。近年來，國內外學者對砷污染的植物、微生物聯合修復技術進行了研究，已獲得大量研究成果[13]，但所研究的植物主要是蜈蚣草，對風車草的研究則鮮有報道。

從長年開發的尾礦區取樣，篩選出對砷具有超富集能力的優勢植株風車草、蜈蚣草及砷耐受性較強的菌株CP3和CP7。利用篩選出來的菌株對砷富集能力最強的風車草在實驗室進行盆栽試驗，考察植物、微生物聯合修復技術對去除砷污染的效果，以期為礦區砷污染的生態修復提供參考。

1 試驗部分

1.1 試驗材料及設備

試驗所需植株、土壤樣品均采自廣西河池某尾礦區。

試驗所用試劑：硝酸，鹽酸，高氯酸，硫脲，抗壞血酸，硼氫化鉀，氫氧化鈉，砷標準溶液，均為分析純；蛋白胨，酵母浸膏粉，瓊脂，均為生化試劑。

試驗所用設備：原子熒光光度計(AFS-99型)，電子天平(JA2003型)，超純水機，pH計(PHS-3C型)，粉碎機，恒溫箱(DHG-9245A型)，數控超聲波清洗器(KQ-250DE型)。

1.2 試驗方法

1.2.1重金屬砷超富集植株的篩選

1)植物及其根際土壤樣品的采集。從尾礦區選取長勢良好的草本植物，連根帶土一并挖起，共13種：鬼針草(Bidens pilosa L.)，南艾蒿(Artemisia verlotorum Lamotte)，藜(Chenopodium album L.)，苦荬菜(Ixeris sonchifolia Hance)，藿香薊(Ageratum conyzoides L.)，木芙蓉(Hibiscus mutabilis Linn)，磚子苗(Mariscus sumatrensis)，大葉醉魚草(Buddleja davidii Franch.)，蜈蚣草(Eremochloa ciliaris(Linn.) Merr.)，苧麻(Boehmeria nivea(L.) Gaudich.)，風車草(Cyperus alternifolius L.subsp.flabelliformis(Rottb.)KüKenth.)，燈芯草(Juncus effusus L.)，飄拂草屬(Fimbristylis Vahl)，每種植物選取株高相近的3株作為平行樣。取相應植物根際的土壤作為土壤樣品。

2)土壤及植物樣品的預處理。將土壤樣品于陰涼干燥處風干，挑去其中的石子，放入研缽中磨碎，過0.15 mm篩。將過篩后的樣品放入50 ℃烘箱中烘干一段時間后取出，放入干燥器中備用。

將植物樣品清洗干凈，晾干，測量其株高和質量(鮮)；然后放進50 ℃烘箱中，累積烘干48 h，再分別測定植株根部和地上部分質量(干)。對植株的根部和地上部分分別破碎，分開標記、保存，備用。

3)土壤pH的測定。稱取通過1.00 mm尼龍篩的風干研磨后的土壤樣品10 g放入50 mL燒杯中，加入去離子水25 mL，攪拌靜置30 min后，用pH計測定土壤pH。每個樣品重復3次，結果取平均值。

4)土壤及植物樣品的消解。稱取一定質量樣品加入聚四氟乙烯消解管中，加少量水潤濕，加16 mL硝酸、4 mL高氯酸，蓋上蓋子，搖勻，放置24 h后置于消解儀中加熱1 h，去掉蓋子繼續加熱。如試樣體積減小，或試樣發黑，則補加2 mL硝酸繼續加熱。溫度控制在200 ℃以下(超過200 ℃樣品會有損失)，直至管內殘余灰白色殘渣，取下冷卻，用1 mL 50%硝酸溶解殘渣，并轉移到50 mL比色管中，用超純水清洗，最后用超純水定容。

5)土壤與植物樣品中砷的測定。采用原子熒光光度法[14]測定土壤及植物樣品中砷質量分數。測定條件：負高壓300 V；總燈電流50 mA，主輔陰極各25 mA；原子化器高度8 mm；載氣300 mL/min，屏蔽氣900 mL/min。加入還原劑砷標準溶液和樣品溶液后靜置30 min左右，保證砷在反應前已被還原成正三價。

6)植物體內砷遷移率和富集率計算。

1.2.2砷富集微生物的篩選

1)初篩。取砷質量分數最高的植物根際土壤作為篩選微生物土壤樣品。從該土壤樣品中分離的微生物對砷的耐受性較好。

取10 g土壤樣品加入到含有玻璃珠的90 mL無菌水中，漩渦振蕩器振蕩搖勻，再分別取1 mL加入到無菌水中，依次稀釋成質量濃度為10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8g/mL土壤懸濁液。取質量濃度為10-6、10-7、10-8g/mL的土壤懸濁液各200 μL涂布于LB固體培養基上，每個梯度設3次重復，置于37 ℃培養箱中培養，待菌落長出后挑取外形明顯不同的單菌落劃線培養，備用。

2)復篩。將初篩得到的細菌接種到LB液體培養基中，于37 ℃、180 r/min條件下培養12 h，用滅菌后的離心管在10 000 r/min速度下離心后，倒掉上清液，控干水分，菌體備用。

配制砷質量濃度為5 mg/L的LB液體培養基，每瓶裝液體積100 mL，滅菌后，在超凈臺中稱取菌體1 g加入到培養基中，每個菌株重復3次，以不加菌體的含砷LB培養基作為對照，于37 ℃、180 r/min條件下培養12 h后，在10 000 r/min速度下離心，利用原子熒光光度法測定上清液中砷質量濃度。

1.2.3植物、微生物協同修復砷的效果

1)砷富集微生物的培養。將復篩得到的砷富集菌株CP3、CP7接種到含100 mL LB液體培養基的三角瓶中，在37 ℃、180 r/min條件下培養12 h，之后用LB液體培養基分別將單菌株及2個菌株混合液調整至含菌量相等，備用。

2)溫室盆栽試驗。盆栽試驗在溫室大棚中進行。供試風車草購自河池當地花卉市場，植株長勢一致。供試土壤采自未遭受重金屬污染的公園，經風干破碎過3 mm篩，混勻后按每盆1 kg土加入到12個花盆(上口直徑15 cm，下口直徑10 cm，高10 cm)中，每盆各種植1株風車草，加入50 mL配好的營養液，緩苗7 d，之后向每個花盆中加入一定體積砷標準溶液(質量濃度 1 mg/mL)，使盆栽土砷質量分數為5 mg/kg，然后加水保持濕潤(加水量保持在田間持水量的60%)，平衡7 d。將調整好的CP3、CP7及二者混合菌液各20 mL加入到風車草根部，每組重復3次，以不加菌的風車草為對照，記為ACK。每2 d澆水1次，保持含水量，10 d后加1次營養液。

60 d后，將風車草整株取下，洗凈，用5 mmol/L硝酸鈣溶液浸泡根部15 min,之后用去離子水洗凈，殺青、烘干，測定風車草的生物量、株高及砷質量分數。

1.3 數據處理

試驗數據采用Excel 2007和SPSS20.0軟件進行統計分析。每個樣品均重復3次，結果取平均值。選用最小顯著性差異法進行多重比較的方差分析(α=0.05)。

2 試驗結果與討論

2.1 尾礦區優勢植物生物量及根際土壤pH的測定

尾礦區13種優勢植物樣品生物量及根際土壤pH的測定結果見表1。

表1 13種優勢植物樣品生物量及根際土壤pH測定結果

由表1看出：尾礦區分布的各種優勢植物的長勢區別較明顯;其中，藿香薊、木芙蓉、蜈蚣草3種植物質量(鮮)均低于20 g，說明這3種植物的生物量相對較低，但并不能說明它們對砷的富集效果一定低于其他植物，還需進一步驗證；尾礦區13種優勢植株的根際土壤幾乎都呈弱酸性，會使土壤中的重金屬離子處于活性狀態，很容易被植物體吸收和轉化。這對研究植物對重金屬的富集效果非常有利。

2.2 尾礦區優勢植株及其根際土壤砷質量分數的測定

尾礦區優勢植株及其根際土壤砷質量分數測定結果見表2。

表2 尾礦區優勢植株及其根際土壤砷質量分數

由表2看出:尾礦區13種植物及其根際土壤的砷質量分數差別較大;鬼針草、藜、苦荬菜、蜈蚣草、風車草、燈芯草6種植物的地上部分的砷質量分數均高于其對應地下部分根系中的砷質量分數，說明這6種植物對砷有一定遷移轉化能力，能將砷從土壤中轉移至植物地上部分，通過收割植物方式可以將砷從土壤中分離去除。

2.3 植物對砷的遷移率和富集率

植物、微生物聯合修復重金屬污染土壤是今后重金屬修復領域研究的重點和熱點[15]。微生物在結合重金屬的同時還產生一些有機酸、生長素等物質，可促進植物對重金屬的吸收、累積及植物生長[16]。13種優勢植物樣品對砷的遷移率和富集率計算結果如圖1所示。

圖1 植物樣品對砷的遷移率和富集率

由圖1看出：具有較高遷移率、富集率的只有蜈蚣草和風車草；風車草的遷移率和富集率均優于蜈蚣草，富集率高達589%，遷移率高達67%。蜈蚣草對砷的吸附效果已有研究[17-18]。風車草適應性強，生長旺盛且株形較大，雖在水土保持方面有較好的應用[19]，但對砷的吸附研究尚未見有報道：因此，選擇風車草進行盆栽試驗。

2.4 砷富集微生物初篩

經過初篩，共得到外形明顯不同的細菌10株，分別標記為CP1～CP10。不加菌體的含砷LB培養基為對照，記為CK。將這10株菌株挑取單菌落，純化培養，為下一步試驗做準備。

2.5 砷富集微生物復篩

上清液中的砷質量濃度測定結果見表3。可以看出，10株菌株對砷均具有一定富集能力，其中，CP3和CP7菌株對砷的富集能力更強。這是因為：在液體中，菌體表面含有多種極性官能團，可以提供吸附活性位點，這些活性位點與砷離子結合[20]；而且，死菌也可以通過細胞壁表面的一些化學基團吸附重金屬[21]。微生物對砷除具有富集作用之外還具有轉化功能，利用本身的氧化還原能力和甲基化作用可將砷轉化為低毒形態，以此促進植物對砷的吸收[22]，因此，選取這2株菌進行盆栽試驗，并通過植物-微生物的協同作用考察對砷的富集效果。

表3 上清液中的砷質量濃度測定結果

注：數據中的不同字母代表存在顯著性差異(P<0.05)。

2.6 盆栽試驗結果

2.6.1風車草的生物量

風車草試驗前后的生物量測定結果見表4。可以看出：經過培養，風車草的株高和質量(鮮)均有所增加，表明風車草在設定的培養環境中能夠生長；添加菌株的試驗組株高和質量(鮮)均高于對照組，添加復合菌的試驗組株高和質量(鮮)分別比對照組的高57.80%和46.51%，表明添加菌株尤其是復合菌株有助于風車草生長。微生物的代謝活動在一定程度上可改善土壤理化性質，產生一些生長素類物質，促進植物生長。

表4 風車草試驗前后的生物量測定結果

2.6.2風車草中的砷質量分數

風車草中的砷質量分數及遷移率、富集率測定結果見表5。可以看出，經過一段時間生長，土壤中所加入的砷一部分被風車草吸收，加入菌的試驗組砷遷移率提高21.08%，富集率提高64.87%，表明加入菌株更有利于風車草對砷的遷移和富集。微生物的代謝活動在一定程度上可改善土壤的理化性質，促進植物對土壤中重金屬的吸收和累積，提高土壤修復效率。

表5 風車草中的砷質量分數及砷遷移率、富集率測定結果

注：同一列數據中的不同字母代表存在顯著性差異(P<0.05)。

3 結論

研究結果表明，礦區周邊長勢良好的風車草加復合菌對砷的富集和遷移有較好效果，可以有效降低土壤中砷質量分數。實驗室盆栽試驗結果表明，添加復合菌，植物長勢良好，未出現重金屬毒害現象，其對砷的富集率和遷移率明顯提高，這證實復合菌有助于風車草對砷的富集和遷移。在對砷的分離去除過程中，微生物和植物可共同發揮作用。