微流動注射法檢測痕量鉻及對大學(xué)生科技創(chuàng)新能力的培養(yǎng)

任春艷, 于曙光, 馬圓圓, 吳言凌， 師進(jìn)生

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 化學(xué)與藥學(xué)院, 山東 青島 266109)

1 實驗項目和實驗原理

近年來,為提高大學(xué)生科技創(chuàng)新能力和科技創(chuàng)新意識的大學(xué)生科技創(chuàng)新項目在各大高校中得到大力推廣。學(xué)生通過走進(jìn)實驗室,參與教師的科研項目,不僅開闊了眼界,接觸到了許多前沿科技,而且可以把課本上學(xué)到的理論和實驗現(xiàn)象、實驗結(jié)論相結(jié)合,從而達(dá)到使理論指導(dǎo)實驗,實驗反過來驗證理論的目的[1-2]。我校應(yīng)用化學(xué)專業(yè)大二學(xué)生剛剛學(xué)習(xí)了儀器分析課程中的流動注射,在儀器分析實驗課程中學(xué)習(xí)了金屬離子檢測,我們試圖通過該實驗把二者有效地結(jié)合,提高分析方法的靈敏度,減少試劑使用量,盡量實現(xiàn)金屬離子的現(xiàn)場實時測定。

微流控芯片是把一整套化學(xué)分析實驗室濃縮放到一個幾平方厘米的小芯片上,加入壓力使液體流動,從而實現(xiàn)對待測物質(zhì)進(jìn)行化學(xué)實驗分析的目的[3]。由于微流控芯片技術(shù)具有試劑消耗少、測試速度快、儀器質(zhì)量輕等優(yōu)點,近年來在化學(xué)、環(huán)境科學(xué)、生命科學(xué)、食品科學(xué)等學(xué)科中得到了廣泛應(yīng)用[4-6]。而建立在微流控芯片基礎(chǔ)上的微流動分析技術(shù),克服了傳統(tǒng)流動分析技術(shù)試劑用量大、產(chǎn)生廢液多、實驗管路又長又粗等缺點,實驗的精密度和靈敏度也有所提高。化學(xué)發(fā)光分析法常與流動注射結(jié)合使用[7-9],魯米諾-H2O2體系是最常用的發(fā)光體系之一,催化劑(如金屬陽離子)會特別迅速地加快其反應(yīng)速率[10-11],從而在幾十秒內(nèi)就可以使發(fā)光強度達(dá)到最大。基于以上原理,本文提出一種建立在微流控芯片基礎(chǔ)上的微流動注射技術(shù),采用鉻離子催化魯米諾- H2O2體系發(fā)光,通過測定發(fā)光強度檢測水體中的痕量鉻離子。

混合對一個化學(xué)反應(yīng)是最基本的,也是最重要的,尤其對微流控芯片這樣一個只有幾平方厘米的體系而言。其用于反應(yīng)的通道很窄,只有幾百微米,所用的試劑量也極少,只有幾十微升,因而反應(yīng)液之間的混合至關(guān)重要。本文設(shè)計并制作了一種雙扇形微流控芯片,第一個扇形結(jié)構(gòu)有效增加了通道長度,提高了混合效果,第二個扇形結(jié)構(gòu)使發(fā)光區(qū)域面積增大,可有效增大反應(yīng)靈敏度,從而實現(xiàn)對水體中鉻的實時測定。

2 實驗過程

2.1 玻璃芯片的設(shè)計及制作

學(xué)生在接到科研任務(wù)后,首先查閱了大量相關(guān)文獻(xiàn),再經(jīng)過與教師的討論,決定采用傳統(tǒng)光刻和濕法刻蝕技術(shù)合成微流控芯片。經(jīng)過繪圖—曝光—顯影—除鉻—刻蝕—切割—除鉻—鍵合等一系列步驟,在本院實驗室中成功制作了玻璃微流控芯片,其通道結(jié)構(gòu)如圖1所示。為驗證該芯片的混合效果,利用恒流泵分別將氫氧化鈉溶液和酚酞的乙醇溶液引入芯片,通過體視顯微鏡觀察并記錄微通道中粉紅色液流的寬度,根據(jù)式(1)可計算出微混合器的混合程度[12]。在流經(jīng)第一個扇形結(jié)構(gòu)混合單元后,粉紅色液流就充滿了整個通道,計算可得該微混合器的混合效果達(dá)到100%,表明氫氧化鈉和酚酞已全部混合均勻。由此可以證明芯片制作成功,可用于下一步的測試實驗。

(1)

實驗時使魯米諾和H2O2分別由A、B兩入口進(jìn)入通道,混合后進(jìn)入第一個扇形結(jié)構(gòu)區(qū)域,隨后在S口注入Cr3+溶液,與魯米諾和H2O2完全混合后,流入第二個扇形結(jié)構(gòu)區(qū),此時鉻離子催化魯米諾-H2O2體系發(fā)光,光電倍增管接收光信號。廢液經(jīng)W口流出。我們設(shè)計的微流控芯片中,扇形區(qū)域為回形結(jié)構(gòu),有效拉長混合長度,其總長為19.5cm,可以充分保證魯米諾和H2O2混合完全。因為扇形結(jié)構(gòu)區(qū)域面積較大,能增大發(fā)光強度,從而可提高檢測結(jié)果的靈敏度和精密度。

圖1 扇形構(gòu)造的微流控芯片(尺寸單位:mm)

2.2 實驗方法

2.2.1 溶液的配制

(1) 魯米諾母液的配制。分析天平準(zhǔn)確稱取0.177 2g魯米諾固體,溶于2mL的1mol/L的NaOH溶液中,溶解后轉(zhuǎn)移到100mL的容量瓶中,定容刻度,搖勻。該母液應(yīng)避光冷藏保存。

(2) 過氧化氫母液配制。準(zhǔn)確吸取102μL30 %的H2O2溶液于100mL容量瓶中,再加入超純水定容至刻度。避光保存。

(3)Cr3+母液的配制。用分析天平稱取0.2665gCrCl3·6H2O,加入少量硝酸,溶解定容至100mL。由于玻璃瓶對Cr3+有吸附性,所以配好的Cr3+母液需放在塑料瓶中。

2.2.2 實驗方法

實驗所用的魯米諾溶液和過氧化氫溶液應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配,魯米諾溶液可由其儲備液稀釋到實驗所需濃度。首先,向芯片的A、B兩入口通過恒流泵,以一定流速分別通入魯米諾溶液和過氧化氫溶液,在S入口以相應(yīng)流速通入超純水；等到電腦顯示器上的數(shù)值趨于平穩(wěn)時,通過六通閥注射Cr3+樣品,超純水?dāng)y帶Cr3+離子溶液進(jìn)入到芯片檢測區(qū)；進(jìn)入檢測區(qū)的Cr3+催化已混合好的魯米諾和H2O2發(fā)生化學(xué)發(fā)光,光信號由光電倍增管收集,傳遞到N2000色譜工作站(賽智科技(杭州)有限公司)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

3 實驗結(jié)果與討論

3.1 條件實驗

3.1.1 反應(yīng)物含量對化學(xué)發(fā)光強度的影響

有諸多因素會影響化學(xué)發(fā)光強度數(shù)值,尤其是反應(yīng)底物的濃度,所以需要對魯米諾和H2O2的含量進(jìn)行優(yōu)化選擇。利用雙因素實驗,同時調(diào)節(jié)魯米諾和H2O2的質(zhì)量濃度,使之分別在1.0×10-4～8.0×10-4mol/L和4.0×10-3～2.0×10-2mol/L之間,加入1.0×10-10mol/L鉻離子溶液,檢測其化學(xué)發(fā)光強度,其結(jié)果如表1所示。

由表1可以知道,隨著魯米諾和H2O2質(zhì)量濃度的增大,化學(xué)發(fā)光強度逐漸增強,當(dāng)二者濃度分別為5.0×10-4mol/L和1.0×10-2mol/L時,發(fā)光強度達(dá)到最大。此后隨魯米諾和H2O2濃度繼續(xù)增大,化學(xué)發(fā)光強度反而有所下降。這可能是由于魯米諾含量過高時,會有少許魯米諾溶液被吸附在芯片的通路上,從而降低實際參與反應(yīng)的魯米諾含量；H2O2含量過高時,在堿性環(huán)境下,H2O2會部分被解離生成氧氣離開反應(yīng)體系,從而減少了參加反應(yīng)的H2O2的含量。因此,確定使用魯米諾和H2O2濃度分別為5.0×10-4mol/L和1.0×10-2mol/L。

表1 魯米諾和H2O2的濃度對發(fā)光強度的影響 mV

3.1.2 流速和通道寬度對化學(xué)發(fā)光強度的影響

魯米諾和H2O2在有金屬離子參與催化時,反應(yīng)速度很快,一般在50 s內(nèi)發(fā)生反應(yīng)發(fā)光,而且此時發(fā)光強度最強,隨后又會減弱。由于此反應(yīng)的時間很短,因此反應(yīng)試劑流速的選擇也是相當(dāng)重要的。同時,相同流速的液體流經(jīng)不同寬度芯片時,也會使單位面積芯片中反應(yīng)物濃度不同。也就是說,反應(yīng)物流速和芯片寬度會共同影響發(fā)光強度。因此,固定魯米諾和H2O2濃度分別為5.0×10-4mol/L和1.0×10-2mol/L,通入1.0×10-10mol/L鉻離子溶液,調(diào)節(jié)魯米諾和H2O2的流速分別為20、40、60、80、100 μL/min,相應(yīng)調(diào)節(jié)超純水流速,同時采用不同寬度的微流控芯片,其通道寬度分別為100、200、300和400 μm,檢測其化學(xué)發(fā)光強度,其結(jié)果如表2所示。

表2 液體流速和通道寬度對發(fā)光強度的影響 mV

通道寬度/μm發(fā)光強度液體流速/μL·min-1204060801001002189126120105200662223983803613008534852651850640073301483472453

由表2可知,隨著魯米諾和H2O2流速的加快以及通道寬度的增大,化學(xué)發(fā)光強度迅速增大。可能是由于流速和寬度增加時,將更多的魯米諾和H2O2注入芯片,濃度增大,因而發(fā)光強度增大。但當(dāng)流速大于60 μL/min,通道寬度大于300 μm后,化學(xué)發(fā)光強度開始下降。這可能是由于流速的增加,會讓反應(yīng)物質(zhì)在微流控芯片測試區(qū)的滯留時間變短,而寬度增加則會使反應(yīng)物濃度減小,使檢測靈敏度降低。綜合考慮以上各種因素的影響,選擇魯米諾和H2O2的流速為60 μL/min,相應(yīng)超純水流速為120 μL/min,微流控芯片的通道寬度為300 μm。

3.2 鉻離子的標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢出限

在上述實驗條件下,通入不同濃度鉻離子標(biāo)準(zhǔn)溶液,測定其發(fā)光強度。每個試樣平行測定3次,取平均值,以發(fā)光強度對鉻離子濃度作圖得標(biāo)準(zhǔn)曲線,如圖2所示。由圖2可見,線性方程為:I= 1.48 × 1010c+138.3(R2= 0.996,I: 發(fā)光強度(mV),c: Cr3+濃度(mol/L)),線性范圍1.0×10-11～ 1.0×10-8mol/L,跨越3個數(shù)量級。同時對空白試樣連續(xù)進(jìn)樣7次,計算標(biāo)準(zhǔn)偏差S,隨后用3倍的標(biāo)準(zhǔn)偏差(3S)除以線性方程的斜率,計算得到該方法的檢出限是7.91×10-12mol/L,說明該方法的靈敏度很高。

圖2 Cr3+的標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.3 精密度實驗

上述鉻離子的標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限說明,該方法測定鉻離子準(zhǔn)確度和靈敏度均很高,而重復(fù)性實驗可以驗證其精密度。由此對質(zhì)量濃度為1.0×10-8mol/L 的鉻離子溶液連續(xù)進(jìn)樣7次,測定其發(fā)光強度,并通過標(biāo)準(zhǔn)曲線換算濃度,計算標(biāo)準(zhǔn)偏差和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差,其結(jié)果如表3所示。該方法的標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.89×10-10,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.81%,精密度良好。

4 結(jié)語

本文利用大二應(yīng)用化學(xué)專業(yè)學(xué)生的大學(xué)生科技創(chuàng)新項目,在普通實驗室中,學(xué)生自己設(shè)計并制作了扇形結(jié)構(gòu)的玻璃微流控芯片。在保證100%混合效果的基礎(chǔ)上,利用堿性條件下Cr3+催化魯米諾-H2O2發(fā)光體系,采用微流動注射分析法,對水體中的鉻離子進(jìn)行了測定。所得結(jié)果如下:

表3 精密度實驗

(1) 探討了魯米諾濃度、H2O2濃度及流速和微流控芯片通道寬度等實驗條件,對發(fā)光強度的影響,得到最佳實驗條件為:魯米諾濃度為5.0×10-4mol/L,過氧化氫濃度為1.0×10-2mol/L,二者流速為60 μL/min,微流控芯片的通道寬度為300 μm。

(2) 在上述最佳條件下,確定Cr3+的標(biāo)準(zhǔn)曲線I= 1.48 × 1010c+138.3(R2=0.996,I: 發(fā)光強度(mV),c: Cr3+濃度(mol/L)),線性范圍是1.0×10-11～ 1.0×10-8mol/L,線性范圍較大,相關(guān)性良好。

(3) 精密度實驗表明,標(biāo)準(zhǔn)偏差和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別是3.89×10-10和3.81%,檢出限是7.91×10-12mol/L,精密度良好,檢出限很低。

綜上所述,該實驗方法有測定速度快、溶液用量少、儀器簡單、便于攜帶等優(yōu)點,同時實驗準(zhǔn)確度、靈敏度和精密度均很高,而檢出限很低,因此是一種十分有前途的測定方法。如能有效去除水體中其余金屬離子的干擾,則有望實現(xiàn)痕量鉻離子的現(xiàn)場測定,同時也為其他金屬離子的檢測提供借鑒。

通過該創(chuàng)新性實驗項目,使大學(xué)生參與到教師的科研項目中來,學(xué)生學(xué)到了很多書本上沒有的知識,知識面得到有效拓寬,對全面提高學(xué)生的專業(yè)素養(yǎng)和科研能力起到了很好的作用。