蛋白磷酸酶2A在線粒體質量控制中的作用研究進展

車 琳，林忠寧，林育純*

（分子疫苗學和分子診斷學國家重點實驗室，廈門大學公共衛生學院，福建 廈門 361102）

蛋白磷酸酶2A（protein phosphatase 2A，PP2A）是真核細胞內廣泛表達的絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶家族成員，參與外源物誘導細胞毒性損傷和致癌過程中關鍵調控蛋白的可逆性磷酸化調節[1]。PP2A全酶是由結構亞基A（65 kD）、催化亞基C（36 kD）和不同的調節亞基B（50～130 kD）家族成員構成的異源三聚體蛋白復合物[2]；其中，部分PP2A亞基，如PR70、Cα和B55亞基等，在外源因素誘導下可選擇性轉位分布于線粒體，見圖1因此，PP2A在參與線粒體介導的細胞周期[3]、凋亡[4]、壞死[5]和線粒體自噬[6]等生理或病理過程中具有重要作用。線粒體質量控制（mitochondrial quality control，MQC）是通過對處于內、外源因素刺激條件下線粒體形態、數量與質量的多維調控，維持細胞內穩態的新機制[7]。研究表明，PP2A通過直接或間接對線粒體蛋白、線粒體轉位分布蛋白、以及調控線粒體功能相關蛋白的去磷酸化作用，參與介導線粒體生物發生、線粒體動態線粒體氧化還原平衡和線粒體自噬等重要生物學過程，進而影響MQC穩態。本綜述著重闡述PP2A參與外源物誘導細胞線粒體調控網絡對維持細胞內環境穩態的分子機制，旨在分析PP2A不同亞基對MQC相關信號分子的去磷酸化調控作用，為研究環境因素暴露誘導線粒體關聯性毒性損傷和致癌作用提供線索。

1 PP2A參與線粒體生物發生的調節

線粒體生物發生（mitochondrial biogenesis，MB）是指通過線粒體前體的生長和分化形成新線粒體的過程，以維持線粒體功能障礙后代謝穩態的適應性反應[8]。生理狀態下，MB主要取決于線粒體基因組和核基因組的穩定性，包括核編碼的線粒體蛋白合成和輸入，以及線粒體DNA（mtDNA）的復制和線粒體編碼蛋白的合成。病理條件下，線粒體作為外源物誘導毒作用的靶細胞器之一，其生物發生可參與調控機體肝細胞毒效應的產生[9]，以及介導結腸癌、阿爾茨海默病等的發生發展[10-11]。

圖1 PP2A全酶亞基及其線粒體分布

丙型肝炎病毒（HCV）作為慢性丙型肝炎的誘因，不僅與肝致癌作用相關，而且其與胰島素抵抗介導的代謝性疾病如2型糖尿病的關聯性也逐步被證實。體外試驗中，采用可誘導表達HCV功能性基因型1a完整cDNA的UHCV-57.3細胞，闡明HCV通過誘導PP2A-C亞基表達增加促進絲/蘇氨酸激酶Akt中Ser473去磷酸化修飾，阻礙胰島素信號傳導，減少經由線粒體途徑的糖異生和糖原合成；采用覆蓋HCV中開放讀碼框（3～3 010 aa）的cDNA片段（9 kb）構建的HCV轉基因小鼠，體內試驗發現肝臟中PP2A-C高表達、并且與胰島素信號傳導功能降低呈正相關；而且，胰島素信號傳導功能降低進一步在慢性丙型肝炎患者的肝活檢組織樣本中被證實[12]。過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子-1α（peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1 alpha，PGC-1α）通過激活參與能量代謝的轉錄因子，如核呼吸因子1（NRF1）和2（NRF2），控制核編碼的線粒體氧化磷酸化（OXPHOS）相關基因的表達以及參與線粒體蛋白轉錄、蛋白質輸入和組裝的核編碼因子的表達，調節MB[13-14]。Bernsmeier等[15]發現，HCV誘導肝癌Huh7細胞和HCV感染培養的Huh7.5.1細胞中PP2A-C上調，增加叉頭盒轉錄因子O1中Ser256位點去磷酸化，通過促進MB調節因子PGC-1α表達和控制肝癌細胞中葡萄糖代謝穩態，抑制機體血糖水平，有利于控制2型糖尿病的發展。此外，研究表明，血管緊張素 II（AngII）抑制原代人主動脈內皮細胞（HAECs）中 PGC-1α表達，經由MB介導eNOS生成下降，造成血管損傷；當HAECs細胞瞬時轉染Ad-PGC-1α質粒高表達PGC-1α后，PP2A-Aα/β與eNOS相互作用減弱，eNOS中Ser1177去磷酸化水平受到抑制，最終經由MB抑制AngII誘導的NO生成減少；提示抑制PP2A-Aα/β活性為PGC-1α介導的MB調節eNOS生成和參與血管內皮細胞功能修復提供了新機制[16]。Liu等[17]研究發現，一氧化氮前體藥JS-K處理人肝癌HepG2和SMMC-7721細胞24 h后，NO釋放增加，被高度活化的PP2A-C促使p-Bcl-2中Ser70位點去磷酸化增加，誘導肝癌細胞線粒體依賴性凋亡。

線粒體分裂和融合的協調機制對于MB也發揮重要作用[18]。線粒體分裂蛋白（如Drp1）是維持MQC的關鍵組成部分，在神經細胞研究中，分別給予SD大鼠原代海馬神經元細胞瞬時轉染PP2A-Bβ2和Drp1表達質粒，均發現線粒體分裂增加，闡明PP2A-Bβ2通過介導Drp1中Ser656去磷酸化，影響MB、抑制樹突生長發育、增強突觸形成，進而調節海馬神經元的正常生長發育[19]。Ljubicic等[20]發現，釀酒酵母中PP2A（即同源物Sit4p、Pph21p和Pph22p）的缺失，可降低對蛋白激酶SNF1的去磷酸化作用，影響mtDNA損傷相關的線粒體疾病等，為菌株增殖創造條件，提供了PP2A在維持真核生物MB中重要地位的證據。

2 PP2A參與線粒體動態平衡的調節

線粒體處于持續分裂和融合的動態平衡[21]。其中，線粒體動態（mitochondrial dynamics，MD）作為參與維持線粒體數目、形態和功能的主要因素，對于維護線粒體關聯性內質網膜（mitochondria-associated endoplasmic reticulum membrane，MAM）[22]和線粒體-核通訊（mitochondria-nucleus communication，MNC）[23]等多細胞器功能平衡至關重要。而且，外源因素誘導線粒體分裂或融合的紊亂，導致MD和線粒體功能障礙，促使細胞走向線粒體依賴性凋亡[24]、焦亡[25]和鐵死亡[26]等調節性細胞死亡結局，在外源物誘導致癌作用和損傷相關疾病中發揮重要的調控作用[27-28]。

線粒體分裂和融合在哺乳動物細胞由高度保守的鳥苷三磷酸酶家族介導[29]，包括促進線粒體分裂的Drp1蛋白、促進線粒體融合的融合蛋白 1（mitofusin 1，Mfn1）、融合蛋白 2（mitofusin 2，Mfn2）以及視神經萎縮蛋白 1（optic atrophy 1，OPA1）[30]。這些蛋白均受到翻譯后修飾的調控，主要包括磷酸化[31]、泛素化[32]和SUMO化[33]等，調節其在線粒體上的豐度和功能活性。其中，磷酸化作為調控線粒體蛋白最廣泛的翻譯后修飾形式[34-35]，其對應的去磷酸化修飾報道尚少。研究發現，PP2ABβ2通過其N端（1～24 aa）的線粒體靶向序列，將異源三聚體PP2A募集定位到線粒體外膜，誘導線粒體分裂，從而增加對神經元PC12細胞的損傷；進一步研究表明，PP2A-Bβ2向線粒體的轉位是通過其N端的3個Ser殘基磷酸化調節，Ser20～22磷酸化的PP2A-Bβ2對Drp1中Ser656去磷酸化受到抑制，進而阻礙線粒體分裂，打破MD平衡，誘導神經元PC12細胞凋亡，為探索脊髓小腦性共濟失調12亞型等神經退行性疾病的發病機制提供了PP2A介導去磷酸化調控的依據[36]。

細胞焦亡是一種炎性調節性細胞死亡形式，由穿孔素GSDMD、Caspase-1和炎性小體NLRP3等分子介導[37]。其中，NLRP3是一種多蛋白復合物，作為胞質模式識別受體，可感知作用于機體細胞的內、外源性危險信號；當損傷相關分子模式，如高遷移率族蛋白1和ROS等，激活NLRP3與銜接子ASC形成炎性小體時，Caspase-1激活導致線粒體膜損傷，膜通透性改變，伴隨促炎細胞因子IL-1β和IL-18等的釋放，導致細胞焦亡[38]。其中，相關蛋白的轉錄和翻譯后修飾調控模式介導NLRP3激活、以防止其異常活化參與MD相關的膜損傷分子機制受到關注。Stutz等[39]發現NLRP3存在3個保守的磷酸化位點，分別位于其Pyrin結構域（PYD）（人Ser5或小鼠Ser3）、PYD和NOD結構域之間（人Ser161或小鼠Ser157），以及LRR結構域（人Ser728或小鼠Ser725），其激活受PYD結構域的磷酸化控制。小鼠永生化巨噬細胞（iMOs）中敲低Ppp2ca時，發現NLRP3活化程度顯著降低，表明PP2A通過去磷酸化NLRP3的PYD位點抑制炎性小體組裝，提示作用于PYD的激酶和磷酸酶之間的平衡對于NLRP3激活具有關鍵作用，為靶向NLRP3相關損傷和致癌作用的干預提供了新策略。因此，基于PP2A調控NLRP3活化介導的線粒體動態平衡影響細胞焦亡這一新型死亡方式，為致癌過程中的免疫調控機制和干預研究提供了線索。

目前，PP2A在線粒體分裂和融合事件中的作用存在爭議，PP2A與MD之間的“雙向性”關系與外源物暴露和細胞種類有關。Merrill及其同事發現PP2A-Bβ2抑制是線粒體融合的觸發因素，SD大鼠原代海馬神經元細胞瞬時轉染靶向線粒體的PP2A-Bβ2-GFP質粒后，PP2A-Bβ2線粒體定位增加，通過去磷酸化Drp1中Ser656位點、激活Drp1活性促使線粒體分裂，導致細胞凋亡[40]。Ruvolo等[41]發現神經酰胺促進人早幼粒急性白血病HL60細胞中PP2A-B56α向線粒體外膜的轉位、與定位在線粒體膜上的Bcl-2相互作用，促進Bcl-2去磷酸化，由此破壞線粒體融合，增強神經酰胺誘導HL60細胞凋亡作用。然而，Cho等[42]研究表明，岡田酸對PP2A的抑制作用增強了SD大鼠皮質神經元Drp1中Ser616位點磷酸化，促進線粒體分裂，導致線粒體自噬性死亡。最近一項研究證明在大鼠腦內皮RBE4細胞中，岡田酸抑制PP2A活性，導致內質網應激和氧化應激的發生，促使內質網和線粒體Ca2+穩態失調導致MAM功能障礙，并進一步影響線粒體Drp1和Fis1水平升高，最終導致線粒體分裂和線粒體依賴性細胞凋亡的發生[43]。因此，外源因素誘導不同細胞中PP2A全酶在線粒體的分布和MQC相關蛋白底物選擇性去磷酸化的具體機制尚待研究。

3 PP2A參與線粒體氧化還原平衡的調節

線粒體是維持細胞內環境穩態的氧傳感器，通過電子傳遞鏈產生線粒體ROS（mitoROS），參與對線粒體離子通道（如線粒體外膜VDAC）、mtDNA和酶類功能活性的調節、及其介導線粒體氧化還原（mito-Redox）信號的傳導，維持線粒體氧化還原平衡[44]。外源性因素（生物、物理和化學等）作為誘導細胞毒性損傷和致癌作用過程的主要誘因，可促進mitoROS產生，其參與mito-Redox平衡調節的研究已被廣泛報道[45-46]。同時，環境因素介導PP2A的轉錄調控及其對底物蛋白的選擇性去磷酸化調控參與致癌作用，也已成為關注的熱點[47]。因此，在外源物誘導細胞毒性損傷和致癌作用過程中，PP2A和mito-Redox成為共同關注的焦點。

Xu等[48]采用PC12和SH-SY5Y細胞，闡明雷帕霉素可通過阻止CdCl2誘導mitoROS產生介導的PP2A/JNK/Erk1/2通路，改善鎘引起的神經元凋亡，揭示通過增加PP2A活性具有預防鎘誘導神經系統毒性損傷的潛力。Xie等[49]研究報道，外源H2S及其供體等誘導SH-SY5Y細胞p66Shc中Cys59位點硫化介導了H2S的抗氧化作用，PP2A作為調節p66Shc磷酸化的關鍵蛋白，H2S破壞二者結合，減少mitoROS的產生以保護神經細胞免受應激誘導的衰老，揭示PP2A是參與mito-Redox所致細胞衰老的調節樞紐。Shimura等[50]研究發現，長期低劑量暴露X射線輻射的正常人成纖維細胞MRC-5和TIG-3，其胞內抗氧化的谷胱甘肽水平降低，胞內還原狀態受抑制。過量的mitoROS則促進PP2A-C的氧化失活，造成細胞周期蛋白D1的異常核積累，導致細胞生長遲緩、細胞衰老和基因組不穩定性。在外源物致癌作用過程中，Wilson等[51]研究報道通過應用線粒體-電子傳遞鏈缺陷型人肺癌和乳腺癌細胞系（ρ0細胞），或選擇性肽抑制劑抑制NADPH氧化酶活性，抑制mitoROS產生，可顯著降低PP2AC中Tyr位點的硝化，結果發現隨著PP2A活性降低，乳腺癌基因1（BRCA1）表達恢復，DNA同源重組修復水平顯著提高，顯示肺癌和乳腺癌細胞的氧化還原微環境與PP2A的關聯性可以調節其基因組穩定性。最近，Kim等[52]發現氯硝柳胺誘導非小細胞肺癌細胞系H1299和A549細胞中mitoROS產生，引起線粒體功能障礙（膜電位下降），研究表明經由抑制PP2A癌性抑制因子（cancerous inhibitor of protein phosphatase 2A，CIP2A）、促進PP2A-C激活導致PP2A活性增加，抑制癌細胞增殖，提示開發靶向CIP2A/PP2A-C調節機制的新型PP2A活化因子，對于致癌作用的靶向干預具有潛在應用價值。

4 PP2A參與線粒體自噬的調節

自噬是細胞吞噬自身物質（蛋白質、細胞器等）并降解以維持細胞穩態的過程，因其對不同類型底物的選擇性不同，分為線粒體自噬（mitophagy）[53]、內質網自噬（ER-phagy）[54]和脂自噬（lipophagy）[55]等。近年來，隨著外源因素誘導細胞自噬所介導細胞毒性損傷和致癌作用過程研究的開展，激酶和磷酸酶介導的靶蛋白磷酸化和去磷酸化相關功能性研究也相繼被揭示[56]。Zhou等[57]首次提出PP2A-A亞基作為調節樺木酸（BetA）介導多發性骨髓瘤細胞系線粒體依賴性凋亡和自噬性細胞死亡的開關，發現BetA通過誘導多發性骨髓瘤IM-9細胞中Caspase-3依賴或非依賴途徑影響PP2A活性。穩定高表達Bcl-2的IM-9細胞中，通過抑制Caspase-3活性減輕其對PP2A-A亞基的剪切，導致PP2A-A亞基和Akt的分離，促使PP2A-A亞基以Caspase-3非依賴的方式與死亡相關蛋白激酶結合，從而啟動自噬性細胞死亡，提示PP2A參與的線粒體依賴性凋亡和細胞自噬性死亡的轉換調控，對于抗凋亡耐藥相關的腫瘤治療具有啟示性作用。

線粒體自噬作為自噬的組成類型之一，是自噬溶酶體特異性靶向線粒體降解的一種選擇性自噬[58]；可分別經由PINK1/Parkin[59]、線粒體自噬相關受體（包括Nix/BNIP3[60]和FUNDC1[61]等）和Smad泛素化調節因子1[62]等途徑介導。另外，PP2A在線粒體自噬相關通路上的去磷酸化機制也逐漸被證實。目前國內外研究表明PP2A可以抑制或促進線粒體自噬，與不同細胞類型和外源因素作用有關[63]。Rice等[64]在SH-SY5Y細胞中，發現PP2A-Bβ2亞基線粒體轉位分布促進線粒體自噬的發生以誘導神經細胞凋亡，是神經系統損傷相關疾病的主要機制之一。然而，Qi等[65]研究證明在敲低PINK1的小鼠多巴胺能MN9D細胞中，PP2A-C亞基中Y307磷酸化增強（無活性形式），促使Bcl-2中Ser87磷酸化，導致Beclin1/Bcl-2復合物的解離，抑制所誘導的線粒體自噬。最新一項有關酵母的研究也顯示，酵母中PP2A樣蛋白磷酸酶Ppg1通過與Far8形成蛋白復合物，抑制酪蛋白激酶2介導的Atg32磷酸化，促進Atg32蛋白去磷酸化，抑制酵母線粒體自噬的發生[66]。因此，理清誘導細胞線粒體自噬發生的外源物種類、細胞類型以及PP2A酶復合物組成和底物分子等，對于深入探明PP2A介導MQC在線粒體自噬及其參與致癌作用和腫瘤防制過程中發揮去磷酸化作用機制的研究具有重要意義。

5 總結與展望

線粒體是高度動態的細胞器，作為真核細胞中主要的能量制造者，參與mitoROS的產生、能量代謝和細胞死亡等眾多生物學過程。因此，MQC對于維持機體正常生命活動至關重要。近年來，隨著線粒體基因組學、蛋白質組學和代謝組學等技術的相繼開展，MQC在外源物誘導細胞毒性損傷和致癌過程中的作用及其調控機制不斷被提升[67]，特別是在腫瘤預防、診斷和治療領域，以線粒體為核心靶點的診斷和治療手段不斷完善。迄今，MQC受到多種磷酸酶的調節，如磷酸甘油酸變位酶5（phosphoglycerate mutase 5，PGAM5）、線粒體蛋白酪氨酸磷酸酶 1（protein tyrosine phosphatase localized to the mitochondrion 1， PTPMT1）和 蛋 白 酪 氨 酸 磷 酸 酶 2（protein tyrosine phosphatase 2，SHP2）等。其中，PP2A不同亞基與MQC之間的關聯性已現端倪，見圖2。更重要地，PP2A與線粒體之間尚有許多科學問題有待明確，尤其是腫瘤等重大疾病防制方面，例如進一步鑒定外源物致癌作用和腫瘤細胞中PP2A不同亞基的亞細胞定位及其與線粒體膜結構和功能相關的底物分子，如p53、RB蛋白和環氧合酶2（cyclooxygenase 2，COX-2）等的相互作用和對特異性位點去磷酸化在外源物介導MQC中的作用，以期更加深入解析PP2A調控MQC在線粒體相關多細胞器關聯性（如MAM）中的作用，及其與外源物誘導細胞毒性損傷和致癌作用過程（如mtDNA突變、線粒體代謝重編程和炎癌轉化等）的作用機制，為環境因素暴露和致癌過程生物標志物的篩查與靶向干預，以及腫瘤相關疾病的預防和控制提供新科學依據。

圖2 PP2A參與線粒體質量控制的調節作用