關于滇重樓內生真菌抗菌活性的篩選和菌株鑒定研究

代嬌 宋秋玲 田甜

摘要：采用實驗分析的方法，依靠實驗進一步分析了滇重樓的真菌抗菌活性及其菌株鑒定結果。從實驗結果來看，滇重樓中的金黃色葡萄球菌具有理想的抗菌活性，并且菌株鑒定結果顯示，該菌株為墻粘鞭霉，因此應該得到相關人員的關注。

關鍵詞：滇重樓;內生真菌抗菌活性;菌株鑒定

前言：

滇重樓是一種廣泛分布于云南、貴州等地區的藥材，其根莖可以用藥，具有良好的清熱解毒、消腫止痛的功能，在臨床上常被用于治療咽喉腫痛、毒蛇咬傷等癥狀，其效果顯著。內生真菌是指生活在植物組織內部而不影響植物組織明顯癥狀的真菌，內生真菌可以分泌毒素或者抗菌物質，影響了藥物的臨床應用。

1.實驗與材料分析

1.1原材料的選擇

在本次研究中，選取10株滇重樓為研究對象，所選藥物均為當地化學與生物技術學院保存的菌種。

本次研究中的培養基為：PDA（馬鈴薯培養基）、NB（牛肉蛋白胨培養基）與固體發酵培養基。

1.2對原材料的處理

將本組10株滇重樓發酵物用95%乙醇浸泡之后，超聲處理30min，并用紗布做好過濾;之后取菌絲體，將其加入到80%的丙酮中進行浸泡處理，在經真空泵抽取之后，做好過濾。此時向濾液中添加100ml的乙醇乙酯，之后萃取乙酸乙酯層，并將其與萃取液合并在一次。之后萃取液在經過40℃的減壓蒸餾之后，可以干燥處理，這樣就能獲得粗提取物浸膏。最后，提取100mg的提取物浸膏，并通過1ml無水乙醇完全溶解之后，將最終處理的后獲得的抗菌實驗樣品為實驗品。

1.3發酵物的抗菌活性檢測

采用濾紙片擴散法進行發酵物的抗菌活性檢測，將試菌培養液均勻涂抹在抗菌實驗樣品上，之后在NB平板上的適當位置粘貼蘸取了待測菌種發酵物乙醇提取物的濾紙片，同時選取100μg/ml無菌水與青霉素進行對照，在37℃環境下來培養1d時間，觀察細菌的生長情況，并按照交叉法來測量抑菌圈的變化，評估抑菌效果。

1.4抗菌活性菌株鑒定

在本次研究中，為了能夠獲得更理想的抗菌活性菌株鑒定結果，需要對具有較高抑菌活性的真菌進行形態學與分子學鑒定，這樣就能確定具體的抗菌活性水平。之后在對菌株的活性鑒定過程中，通過PDA培養基進行插片，并按照分離后獲得的滇重樓植物內生真菌的形態特征資料，并將最終的分析結果來進行分屬鑒定。

2.對滇重樓內生真菌抗菌活性的篩選和菌株鑒定結果的分析

2.1內生真菌的抗細菌活性分析

在按照上述方法進行實驗之后，對內生真菌的抗菌活性情況進行了分析，通過實驗結果可以發現，在本次所選擇的10株滇重樓中，由三株無抗菌活性，而另外7株只對黃金色葡萄球菌具有一定的抑制作用，并且對大腸桿菌與產氣腸桿菌無抑制作用，詳細資料如表1所示。

2.2抗菌活性的內生真菌形態鑒定

在對抗菌活性的內生真菌形態進行鑒定之后，鑒定結果顯示，滇重樓菌株屬于粘鞭霉屬，這種真菌的主要特征為：培養過程中可以發現菌絲束，并且外表呈現出白色，且分生孢子聚集之后，其顏色相對暗（相關資料見圖1）。

2.3抗菌活性的內生真菌分析鑒定

鑒定結果顯示，真菌中的PCR擴增條帶具有亮度高、特異性高等優點，并且在對真菌的規格進行分析之后，發現大部分真菌的大小為500-700bp。根據這一結果可以發現，本次研究中擴增出的序列可能為ITS序列，因此可以采用測序分析的方法類來進行內生真菌分析鑒定。之后，按照這一要求技術人員將測序的結果提交給GenBank，之后獲得具體的登入號。

2.4對分析結果的深入研究

滇重樓內生真菌的活性篩選與菌株鑒定具有特異性，這一點在植物生長過程中，確實伴隨大量內生真菌共生的情況，其中依然可以發現大量與宿主相同或者基本相似的生物活性物質[1]。對于相關人員而言，必須要正確認識到滇重樓的藥用價值，該藥物的根莖中含有足夠的甾體化合物，從臨床應用情況來看，滇重樓具有理想的抗微生物、止血等作用。

結論：

從本次研究結果可知，滇重樓內生真菌抗菌活性具有特殊性，可以帥篩選到了具有抗金黃色葡萄球均活性，并且研究結果也證明，滇重樓內的次生代謝物中含有一定量的抗生素環孢菌素C，證明滇重樓內的抗菌活性水平理想。因此在未來工作中，需要通過開展深入研究來判斷其次生代謝產物中的抗菌活性水平，這對于提高滇重樓的臨床藥用價值具有重要意義。

參考文獻：

[1]李靜.滇重樓內生真菌及其抗菌活性檢測和甾體化合物分析[D].四川農業大學，2017.