響應面法優化平菇單核原生質體的制備及再生技術

孔維麗 崔筱 劉芹 袁瑞奇 段亞魁 康源春 孔維威 張玉亭

摘? ? 要：為了提高平菇原生質體融合育種效率，本研究通過構建基于原生質體產量及單核原生質體再生率的響應面模型，優化平菇原生質體制備體系。以平菇菌株黑平16-1為試材，分別通過單因素試驗考察菌絲菌齡（3～6 d）、酶液濃度（0.5%～2.0%）、酶解溫度（28～34 ℃）和酶解時間（3～6 h）對原生質體制備及再生率的影響，并在單因素試驗基礎上，設計4因素3水平的響應面試驗，建立各因素與響應值（原生質體產量和單核原生質體再生率）之間的數學模型，確定原生質體制備及單核原生質體再生的最佳提取工藝。結果表明，最佳提取工藝為菌齡4 d、酶液濃度1.51%、酶解溫度28.3 ℃、酶解時間3.7 h，在此條件下平菇原生質體產量和單核原生質體再生率分別為（2.25±0.21）×107個·mL-1和（6.80±0.42）%，與模型預測值接近（2.27×107個·mL-1和6.83%），方程擬合度良好，該方法適用于對平菇原生質體的制備及單核原生質體再生條件的參數優化。

關鍵詞：響應面法;平菇;原生質體產量;單核原生質體再生率;參數優化

中圖分類號： S646.1+4? ? ? ?文獻標識碼： A? ? ? ?DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2019.12.002

Abstract：? In order to improve the efficiency of Pleurotus ostreatus protoplast fusion breeding， a response surface model based on protoplast yield and mononuclear protoplast regeneration rate was constructed to optimize the protoplast preparation system of P. ostreatus. The effects of mycelium age （3～6 d）， enzyme concentration （0.5%～2.0%）， enzyme solution temperature （28～34 ℃） and enzymatic hydrolysis time （3～6 h） on protoplast preparation and regeneration rate was studied by using P. ostreatus strain Heiping 16-1 as material. On the basis of single factor experiment， the response surface test of 4 factors and 3 levels was designed， and the mathematical model between each factor and response value （protoplast yield and mononuclear protoplast regeneration rate） was established to determine the optimal extraction process of protoplast preparation and single nuclear protoplast regeneration. The results showed that the optimal extraction process was as follows： the mycelium age was 4? d， the enzyme solution concentration was 1.51%， the enzyme solution temperature was 28.3 °C， and the enzymatic hydrolysis time was 3.7 h. Under the above condition， the preparation rate of P. ostreatus protoplasts was（2.25±0.21）×107 cells·mL-1， and the regeneration rate of mononuclear protoplasts was （6.80±0.42）%， which was closed to the predicted value of the model（2.27×107 cells·mL-1， 6.83 %）. In conclusion， the response surface equation was well fitted， and this method is suitable for the preparation of P. ostreatus protoplasts， and the parameter optimization of mononuclear protoplast regeneration conditions.

Key words： response surface method; Pleurotus ostreatus; protoplast yield; regeneration rate of mononuclear protoplast; parameter optimization of protoplast

真菌原生質體融合研究始于20世紀60年代，與常規育種相比，原生質體融合技術可以實現遠緣雜交、擴大遺傳物質的重組范圍以及基因轉化和定向誘變，產生更豐富的遺傳變異，獲得具有突出優良性狀的新類型，在品種改良和選育工作中發揮了積極作用，為食用菌育種提供了有效的手段[1]。原生質體融合技術在香菇[2]、白靈菇[3]、金針菇[4-5]品種選育方面已經開始應用。原生質體再生、誘變、融合育種、轉化育種、基因組重排以及基因組定向編輯技術均需以高產量和高再生率的原生質體為前提。原生質體單核化是平菇、鳳尾菇、金針菇等異宗結合食用菌的菌絲體在原生質體制備過程中的一個普遍現象[6-7]，是快速獲得單核體雜交親本的有效手段，這一技術將為食用菌育種研究開辟一條新途徑，故優化原生質體制備和再生的條件十分必要[8]。由于酶液濃度、菌齡、酶解時間和酶解溫度等因素對原生質體制備的影響各不相同，故在原生質體制備和再生中應綜合考慮相關因素，尋求最佳制備條件[9]。

響應面法（Response Surface Methodology，RSM）是利用合理的試驗設計方案，采用多元二次回歸方程擬合因素與響應值之間的函數關系，通過對回歸方程的分析優化工藝參數，測響應值的一種統計方法[10-11]。響應面法能快速有效地確定試驗過程中的最佳條件，且可對各因子及其交互作用進行評價，被廣泛應用于發酵[12]、食品[13]、藥品[11]中各成分的提取和工藝設計[14]及食用菌多糖[15]提取工藝的研究。

本研究以提高平菇菌絲原生質體產量及單核再生率為目標，應用響應面法優化其制備條件，為研究平菇原生質體融合育種和遺傳轉化奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試菌株：黑平16-1，由河南省農業科學院植物營養與資源環境研究所選育。

溶壁酶購于sigma公司，蔗糖購于國藥集團，硫酸鎂、檸檬酸鈉、山梨醇等試劑菌購于天津科密歐有限公司。

P-buffer：0.6 mol·L-1的緩沖滲穩劑。稱取硫酸鎂39.35 g，檸檬酸三鈉11.76 g，用蒸餾水定容至200 mL后調至pH=5.5，滅菌后備用。

STC：稱取山梨醇18.21 g，二水合氯化鈣0.735 g，加入到80 mL蒸餾水中溶解后加入1 mol·L-1 Tris-HCl（pH=8.0）5 mL， 定容至100 mL，滅菌備用。

PD綜合液體培養基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，蛋白胨2 g，磷酸二氫鉀1 g，硫酸鎂0.5 g，加水定容至1 000 mL。

再生培養基：PDA培養基內添加0.6 mol·L-1甘露醇。

1.2 方 法

1.2.1 菌絲體的制備 PDA培養基上培養6～7 d的平菇菌絲接種到PD綜合液體培養基中，在25 ℃，150 r·min-1搖床中培養3～5 d，過濾收集菌絲備用。

1.2.2 酶液的制備? ? 稱取酶制劑溶于P-buffer中，并用0.25 μm微孔過濾膜過濾除菌，配制成相應濃度酶液。

1.2.3 原生質體的制備? ? 將液體培養的菌絲用5層無菌擦鏡紙過濾，吸干水分，按照菌絲質量與酶液1∶10的比例混合，將三角瓶置于搖床中酶解3～6 h，酶解溫度30～36 ℃，將酶解后的液體過濾到無菌離心管中，充分混勻，于4 000 r·min-1，4 ℃離心10 min，棄上清。加入10 mL STC溶液充分混勻，洗滌2次，于4 000 r·min-1，4 ℃離心10 min，棄上清后再加入10 mL STC溶液充分懸浮，每個處理重復3次，在顯微鏡下鏡檢原生質體，并用血球計數板進行計數。

1.2.4 單核原生質體的再生? ? 原生質體懸浮液稀釋至5×103個·mL-1，吸取100 μL，涂布于再生培養基，25 ℃培養5～7 d，原生質體萌發后，挑取單菌落于新的培養皿，插片培養，顯微鏡檢，計算單核原生質體的再生率，每個處理重復3次，單核原生質體再生率（%）=（再生培養基長出的菌落-PDA培養基長出的菌落-雙核菌落數量）/涂布的原生質體×100。

1.2.5 原生質體制備、單核原生質體再生條件的單因素試驗? ? 在原生質體制備過程中分別考察不同菌齡（3～6 d）、不同的溶壁酶濃度（0.5%～2.0%）、不同的酶解時間（3～6 h），不同的酶解溫度（28～34 ℃）對原生質體產量及單核原生質體再生率的影響。

1.2.6 原生質體制備及單核原生質體再生的響應面試驗? ? 在單因素試驗的基礎上，以菌絲菌齡、酶液濃度、酶解時間和酶解溫度4個因素為自變量，以原生質體產量和單核原生質體再生率為響應值，設計4因素3水平的響應面分析試驗。

1.3 數據統計與分析

采用Design-Expert7.0軟件進行響應面試驗設計、分析及制圖。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 菌絲菌齡? ? 由表1可知，當酶液濃度1.5%、酶解時間4 h、酶解溫度30 ℃時，隨菌絲菌齡即菌絲培養時間的延長，原生質體的產量和單核原生質體的再生率先增加后降低，均于菌齡4 d時達到峰值，原生質體釋放量最大。方差分析結果表明，在相同酶液濃度、酶解時間、酶解溫度，不同菌絲菌齡對平菇原生質體產量及單核原生質體再生率影響均達到顯著水平（P<0.05）。

2.1.2 酶液濃度? ? 由表2可知，當酶解時間3 h、菌絲菌齡4 d、酶解溫度30 ℃時，隨酶液濃度的增加，原生質體產量及單核再生率呈先增加后減少的趨勢，均于酶液濃度為1.5%時達到峰值。方差分析結果表明，在相同酶解時間、菌絲菌齡、酶解溫度，不同酶液濃度對平菇原生質體產量及單核原生質體再生率影響均達到顯著水平（P<0.05）。

2.1.3 酶解溫度 由表3可知，當酶液濃度1.5%、酶解時間4 h、菌絲菌齡4 d時，隨酶解溫度的增加，原生質體產量及單核再生率呈先增加后減少的趨勢，二者均于酶解溫度為30 ℃時達到峰值。方差分析結果表明，在相同酶液濃度、酶解時間、菌絲菌齡，不同酶解溫度對平菇原生質體產量和單核原生質體再生率的影響均達到顯著水平（P<0.05）。

2.1.4 酶解時間 由表4可知，當酶液濃度1.5%、菌絲菌齡4 d、酶解溫度30 ℃時，隨酶解時間的延長，原生質體產量及單核再生率呈先增加后減少的趨勢，均于酶解時間為4 h時達到峰值。分析其原因，如果酶解時間太短，原生質體釋放不完全，而酶解時間太長，新的原生質體不再釋放或釋放量少，而早期釋放的原生質體卻不斷破裂，這樣原生質體的量不但不會增加，反而會減少。方差分析結果表明，在相同酶液濃度、菌絲菌齡、酶解溫度，不同酶解時間對平菇原生質體產量和單核原生質體再生率的影響均達到顯著水平（P<0.05）。

2.2 響應面試驗

運用響應面試驗分析酶液濃度、酶解時間、培養時間、酶解溫度這4個因素（表5）對原生質體產量及單核原生質體再生率的影響，對試驗數據（表6）進行多元回歸擬合，獲得平菇原生質體產量和單核原生質體再生率與各因素變量的二次多項回歸方程模型。

平菇原生質體產量與各因素變量的二次多項回歸方程模型：

Y（1）原生質體產量=-553.597+44.489 16×A+16.886 74×B+16.886 74×C+29.837 05×D-1.117 61×A×B- 1.192 03×A×C-0.175 00×A×D-0.325 00×B×C-0.075 000×B×D-0.112 50×C×D-9.726 9×A2-2.179 73×B2-1.323 63×C2-0.480 41×D2

平菇原生質體再生率與各因素變量的二次多項回歸方程模型：

Y（2）單核原生質體再生率= 1.90+0.25×A-0.100×B-0.033×C+0.050×D-0.23×A×B-0.38×A×C-0.100×A×D+0.075×B×C+0.100×B×D-0.050×C× D-0.65×A2-0.60×B2-0.48×C2-0.70×D2

式中，Y（1）原生質體產量為原生質體產量（×107個·mL-1）;

Y（2）原生質體再生率為原生質體再生率（%）;A為酶液濃度（%）;B為菌絲菌齡（d）;C為酶解時間（h）;D為酶解溫度（℃）。

2.2.1 回歸方程的方差分析? ? 平菇原生質體產量及單核原生質體再生率與酶液濃度、菌絲菌齡、酶解時間和酶解溫度4因素變量的二次擬合方程的方差分析結果（表7）表明，本試驗選用的二階模型具有統計學意義，其顯著性均表現為P<0.000 1，說明所建模型Y（1）原生質體產量和Y（2）單核原生質體再生率均與實際情況擬合度良好，能夠反映平菇原生質體產量及單核原生質體再生率與4因素之間的關系;校正決定系數[R2（adj）]分別為0.911 5和0.887 5，且失擬項差異均不顯著（P>0.05），即模型分別能解釋試驗所選擇4個變量對響應值影響的91.15%和88.75%，說明該模型條件能夠很好地反映實際值，其他影響因素對平菇原生質體產量的影響很小;模型的決定系數（R2）分別0.955 7和0.943 8，表明回歸模型相對于純誤差失擬不顯著（P>0.05），試驗誤差小。綜合說明，此二次回歸方程模型可用于平菇原生質體制備產量及再生率的分析與預測。

根據F值（表7）大小可以判斷，4個因素對平菇原生質體產量[Y（1）原生質體產量]影響程度表現為：酶液濃度（A）>菌絲菌齡（B）>酶解時間（C）>酶解溫度（D），其中A、B、AB、AC及二次項 A2、B2、C2、D2均為顯著影響因素（P<0.05），說明酶液濃度（A）與菌絲菌齡（B）和酶解時間（C）在對平菇原生質體產量的影響上均存在顯著的交互作用（P<0.05）;4個因素對平菇單核原生質體再生率[Y（2）單核原生質體再生率]的影響表現為酶液濃度（A）>菌絲菌齡（B）>酶解溫度（D）>酶解時間（C），其中A和AC及二次項A2、B2、C2、D2均為顯著影響因素（P<0.05），說明酶液濃度（A）與酶解時間（C）在對平菇單核原生質體再生率的影響上存在顯著的交互作用（P<0.05）。

2.2.2 各因素交互作用的響應面分析? ? 對二次回歸方程Y（1）原生質體產量和Y（2）單核原生質體再生率中存在顯著交互作用的因素繪制響應面圖（圖1～圖3），圖中曲面的陡峭程度可以表明變量對因變量（平菇原生質體產量和單核原生質體再生率）的影響程度，響應值呈拋物線形趨勢，因此回歸方程有極大值。

2.2.3 驗證試驗 通過Design Expert 7.0軟件的Optimization Numerical模塊對試驗結果數值分析，確定平菇原生質體產量最高的制備工藝為酶液濃度1.51%、菌齡3.79 d、酶解時間 3.72 h、酶解溫度28.27 ℃，此條件下由公式Y（1）原生質體產量計算平菇原生質體產量的理論值為2.27×107 個·mL-1，由公式Y（2）單核原生質體再生率計算單核原生質體的再生率為6.83%。

為方便實際操作將酶解溫度定為28.3 ℃，菌絲菌齡4 h，在此條件下進行平菇原生質體制備， 3個重復。結果表明，平均原生質體產量為（2.25±0.21）×107個·mL-1，變異系數為9.33%;平均單核原生質體再生率為（6.8±0.42）%，變異系數為6.18%，測定數據穩定，試驗結果可靠，說明二次多項回歸方程模型Y（1）原生質體產量、Y（2）單核原生質體再生率具有一定的實際預測性。

3 結論與討論

原生質體制備與再生過程中產生單核原生質體和雙核原生質體，雙核原生質體保持親本菌株的性狀，而單核原生質體只有親本的一半遺傳信息，常用于易宗結合菌類育種，特點是萌發較晚[16]。Wessels[17]對裂褶菌原生質體的制備與再生中發現再生菌絲中雙核體約占60%～80%，而單核體只有20%～40%，不同金針菇品種單核化率從27.7%～86.5%。單核原生質體作為一個重要的遺傳材料，為食用菌的育種研究開辟了一條新途徑。因此如何從菌絲處理方式、品種等方面提高單核原生質體的制備率具有重要意義。本試驗以單核原生質體再生率為主要目標，菌絲體經過研磨處理，通過單因素試驗發現，菌絲菌齡、酶液濃度、酶解時間、酶解溫度對食用菌菌絲體原生質體產量及單核原生質體再生率的影響均顯著（P<0.05）。

不同類型的食用菌其原生質體及原生質體再生率高產的條件差異較大，根據已有的研究，總結草菇、白靈菇、大球蓋菇和金針菇的最適制備條件，詳見表8。本研究在單因素試驗基礎上，通過響應面試驗優化了評估平菇原生質體的制備及單核原生質體再生條件，即酶液濃度1.51%、菌絲菌齡4 d、酶解時間3.7 h、酶解溫度28.3 ℃，該條件下平菇原生質體產量為（2.25±0.21）×107個·mL-1，單核原生質體再生率為（6.8±0.42）%，與響應面法獲得的二次多項回歸方程模型預測值（2.27×107個·mL-1，6.83%）接近。

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