富血小板纖維蛋白運用于直接蓋髓術的研究進展

楊雪 黎淑芳

【關鍵詞】富血小板纖維蛋白;直接蓋髓術;牙髓細胞

中圖分類號：R781.05?文獻標志碼：A?DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2019.12.015

直接蓋髓術是保存活髓的有效手段，將蓋髓材料覆蓋于暴露的牙髓組織上，隔絕外界刺激，誘導牙髓細胞向成牙本質細胞分化，并為牙髓細胞提供附著空間，最終在穿髓孔處形成管狀修復性牙本質，這是直接蓋髓術理想的組織學表現。牙髓細胞可在各種細胞生長因子作用下向成牙本質細胞分化，而富血小板纖維蛋白（Platelet-rich fibrin，PRF）可緩慢持續(xù)釋放生長因子，進一步影響和引導牙髓細胞的增殖、分化過程。PRF膜已廣泛應用于口腔領域，應用于直接蓋髓術具有較大臨床意義和廣泛研究前景，但仍存在大量問題需要進一步研究，故本文對PRF膜用于直接蓋髓術的相關研究作一綜述。

1?直接蓋髓材料簡介

氫氧化鈣（Calcium hydroxide，CH）作為直接蓋髓材料長期應用于臨床，曾作為衡量其他直接蓋髓劑性能的金標準，但運用于臨床仍有較大的局限性[1～2]。礦化三氧化聚合物（Mineral trioxide aggregate，MTA）是一種新型的蓋髓劑，具有親水性強、生物相容性及封閉性較好等特點。關于MTA與CH用于直接蓋髓術的Meta分析發(fā)現，MTA具有更高的成功率，因其產生的炎癥反應更低，而形成硬度更高的牙本質橋[3]。新型生物陶瓷材料不僅具有良好的生物相容性和封閉性，還有顯著的抗菌作用且無細胞毒性，如iRoot BP具有與MTA相似的促進完整牙本質形成的能力，同時減少牙髓的炎癥反應[4]。生長因子復合蓋髓材料指生長因子與一定的載體材料復合作為一種蓋髓劑，如以納米晶體硫酸鈣半水合物，羥基磷灰石和硫酸鈣半水合物作為貯庫，將轉化生長因子β和血管內皮生長因子加入到貯庫中形成緩釋劑運用于直接蓋髓術中，這些生長因子具有促進牙本質形成的能力[5～7]，但這些外源性生長因子難以獲得，易被體內的蛋白酶破壞，費用高且異體生物材料存在潛在的排異反應。

2?PRF的制備、結構和成分

由Choukroun提出的PRF的制備方法如下：用真空采血管（不含任何抗凝劑）抽取10 mL靜脈血，即刻在400 g（3000 r/min）離心力下離心10 min，靜置5 min;離心后血液可以分成三層：上層為無細胞血漿，中間層為PRF，下層為紅細胞層[8]。PRF的三維結構由纖維蛋白網構成，血小板和白細胞主要分布在紅細胞和PRF凝膠之間的交界處，稱為血沉棕黃層，此區(qū)域可以釋放高濃度生長因子，PRF凝膠的提取物可以時間依賴的方式加速人牙髓細胞（human Dental Pulp Cells，hDPCs）的增殖[9]。He等[10]制備的PRF-hDPCs復合體保存了PRF的結構的完整性，而hDPCs分布于血沉棕黃層，證明此區(qū)域有可能是PRF最有效部位。在近細胞端纖維排列較致密，含大量血小板，膠原纖維排列成疏松多孔網狀支架結構，α-顆粒釋放于細胞和纖維之間，而有些α-顆粒未被釋放，被網狀纖維緊緊包裹，這些纖維對血小板激活起保護作用，隨著纖維蛋白逐漸降解，血小板激活釋放生長因子于纖維蛋白支架中，受膠原纖維保護抵抗蛋白降解，延長了生長因子效應時間。因此，PRF的纖維蛋白網狀結構是其相對延長生長因子作用時間的結構基礎，所含的大量白細胞可能具有很高的免疫學價值[11～12]。

PRF釋放大量生長因子，其中轉化生長因子-β1（transforming growth factor，TGF-β1）影響成牙本質細胞分化，同時上調與牙本質礦化相關的細胞外基質蛋白的基因表達，促進牙髓-牙本質復合體形成[13]。Lin等[14]研究發(fā)現經TGF-β1培養(yǎng)的牙髓細胞，環(huán)氧合酶-2和前列腺素產生E2的水平升高，此作用通過ALK5/Smad2/3和MEK/ERK通路實現，TGF-β1促進前列腺素產生E2的分泌，不僅影響牙髓的炎癥反應，同時參與牙髓細胞的修復過程，這同時也提示了炎癥反應是牙髓修復的早期標志。PRF釋放人類骨形成蛋白（Human bone morphogenetic protein，hBMP），其中hBMP-2、hBMP-7可以明顯增加牙髓細胞堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活性，誘導牙本質涎磷蛋白表達，形成管樣牙本質[15]。而將具有生物活性的蛋白，即生長因子應用于直接蓋髓術是否對活髓保存的成功率有影響，Luiz等[16]對相關動物實驗作了系統性評價，得出結論：在動物模型中，研究最多的蛋白是BMP-7、TGF-β1以及萃取可溶性牙本質基質蛋白;生物活性分子或材料可以促進第三期牙本質的形成，同時初始炎癥反應更輕。如今，將具有促進牙髓細胞增殖分化的生長因子運用到蓋髓材料中，成為蓋髓材料研發(fā)的熱點。

3?PRF作為直接蓋髓術的機制、細胞學及臨床研究

3.1?機制研究

PRF通過PI3K/AKT和MAPK信號通路促進牙髓細胞的增殖和蛋白合成[17]。另外，經PRF處理過的DPSCs高表達成牙本質基因和成骨基因，通過上調骨橋蛋白表達和促進ALP活性促進礦化。研究還發(fā)現PRF膜可以最少在1周內，最長可達28天，緩慢地、持續(xù)地釋放重要的生長因子，意味著PRF可以自身結構為支架釋放生長因子[18]。PRF可以增強成牙本質標志物相關mRNA和蛋白質的表達，如牙本質涎磷蛋白、牙本質基質蛋白-1，此外，PRF通過誘導具有時間依賴性的抗壞血酸和β磷酸甘油來激活ALP活性，促進礦化結節(jié)的形成[19]。不同濃度PRF浸出液對DPSCs的增殖、分化作用不同，楊盼盼等[20]在犬牙髓細胞的體外研究中發(fā)現，0.40濃度的PRF浸出液可促進cDPCs的增殖、趨化作用，但需進一步研究進行驗證。

3.2?PRF膜用于直接蓋髓術的細胞學研究

PRF膜用于直接蓋髓術有其細胞學及機制研究基礎作為理論依據。有研究表明，在一定濃度范圍內，洗滌血小板與富血小板血漿都可以明顯促進大鼠牙髓細胞增殖及礦化[21]。PRF可抑制人牙髓細胞炎癥反應，刺激成牙本質細胞的分化。Kim等[22]將脂多糖加入人牙髓干細胞（hDPSCs）的培養(yǎng)基中，以模擬牙髓組織因外傷或齲病所致細菌感染的炎癥狀態(tài)，研究發(fā)現PRF提取液可使hDPSCs中的IL-1β、IL-6和IL-8的表達下降，并抑制血管內黏著分子-1和細胞內黏著分子-1的表達，但牙本質涎磷蛋白表達量增加、ALP增強。

3.3?PRF膜用于直接蓋髓術的動物研究

在2011年，Orhan等[23]將富血小板血漿（platelet-rich plasma，PRP）用于大鼠切牙直接蓋髓術的體內實驗發(fā)現，成牙本質樣細胞的數目與修復性牙本質的厚度均增加，認為PRP可以誘導大鼠內源性的修復性牙本質形成，但這種蓋髓劑對于牙髓的損傷還要進一步研究。Puspita等[24]發(fā)現PRP可以作為一種誘導巢蛋白表達的直接蓋髓劑，而巢蛋白是一種成牙本質樣細胞特異性表達的蛋白質，為一種調節(jié)細絲蛋白，是成牙本質細胞的功能與分化的標志物，是與牙本質基質分泌能力有關的蛋白，即PRP用于直接蓋髓術能使牙髓組織的成牙本質能力增強。而PRF作為第二代血小板凝聚物，其安全性優(yōu)于第一代血小板凝聚物PRP，不像第一代的PRP，PRF的制備不需要加入牛凝血酶抗凝劑，因而更加簡便、經濟。

3.4?PRF膜用于直接蓋髓術的臨床研究

由于PRF膜的濕潤、強度低的理化性質，PRF膜直接覆蓋在露髓口上，表面濕度較大，其封閉性能較差，應用于臨床直接蓋髓術仍具有一定局限性。因此尋求一種具有良好生物相容性及封閉性的材料，將其與PRF膜聯合應用于直接蓋髓術成為復合蓋髓劑的新選擇。李響等人[25]以PRF/Dycal、Dycal及PRF分別作為蓋髓劑對家兔門齒進行直接蓋髓術，發(fā)現各組中均未見完整修復性牙本質橋形成，這與Moradi等[26]在2015年的研究結果相似，他認為相較于PRP以及Propolis樹脂，MTA仍然是更佳的直接蓋髓劑。分析其原因認為PRF組中直接用玻璃離子水門汀封洞，而玻璃離子對牙髓具有一定的刺激性，會引起牙髓壞死，而PRF/Dycal組氫氧化鈣對PRF膜有一定毒性，且PRF和Dycal邊緣封閉性差，因此需尋求一種與PRF膜具有更好生物相容性，同時具備良好的邊緣封閉的材料至關重要。李威等人[27]將PRP與MTA聯合作為直接蓋髓劑，認為PRP與MTA復合蓋髓具有良好的牙髓修復效果。Woo等[28]研究發(fā)現，相較于單獨PRFe或MTA用于培養(yǎng)HDPCs，PRFe與MTA聯合培養(yǎng)可上調HDPCs牙本質涎磷蛋白、牙本質基質蛋白-1的表達，提高ALP活性，且通過激動BMP/Smad通路促進人牙髓細胞向成牙本質細胞的分化以及礦化。Solomon等[29]在2015年在其病例報告中，將PRF膜聯合Biodentine材料應用于5例17～20歲患者的5顆恒磨牙齲源性急性不可復性牙髓炎的冠髓切斷術以保存根髓，結果術后第3、6、9、12、18、22和24個月復診的臨床檢查以及影像學檢查都表明活髓保存成功。冠髓切斷術與直接蓋髓術都是活髓保存的重要方法，Solomon團隊將PRF膜應用于冠髓切斷術的成功病例，恰恰證明了PRF膜應用于直接蓋髓術也應具有較高的可行性。

4?總結

綜上所述，具有穩(wěn)定釋放生長因子的生物材料是直接蓋髓劑的發(fā)展趨勢，PRF對牙髓損傷的修復作用尚面臨著不少難點問題，比如PRF濃度的不同對于成牙本質效果的影響還未得出準確定論，但由于PRF具有來源豐富、取材方便、可由自體獲得，相較于人工合成或外源性提取的生長因子具有更高的生物安全性、操作簡單、費用低廉等優(yōu)勢，所以其在直接蓋髓術的臨床應用上具有廣泛前景。

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（收稿日期：2019-07-03?修回日期：2019-08-16）

（編輯：潘明志）