新疆產半夏的質量評價△

邢冰，董誠明，李詢，李曼

河南中醫藥大學 藥學院，河南 鄭州 450046

半夏來源于天南星科植物半夏Pinelliaternata(Thunb.)Breit.的干燥塊莖[1]，我國大部分地區均有分布，主產于四川、湖北、河南等省。半夏性溫，味辛，有毒，歸脾、胃、肺經，具有燥濕化痰、降逆止嘔、消痞散結的功效。長期以來，由于生態環境的破壞，加之根腐病害嚴重，種植成本高，半夏野生資源日趨枯竭[2-3]。目前，半夏主產區的產量已經難以滿足市場的需求，而地域廣闊的新疆地區所產的半夏質量評價的優劣尚不清楚。單一指標不能體現半夏總體質量，故需對其進行綜合品質評價。甘肅省西和縣素稱為“中國半夏之鄉”，栽培面積大，全縣1/3的耕地是半夏適宜種植區。本研究將新疆引種半夏與甘肅半夏的質量進行比較，為新疆地區半夏的種植提供依據。

1 材料

1.1 實驗材料

實驗材料為栽培半夏鮮品及加工品，在新疆、甘肅產地收集，經河南中醫藥大學董誠明教授鑒定為天南星科植物半夏Pinelliaternata(Thunb.) Breit.的干燥塊莖。

1.2 儀器及試劑

Waters e2695 UV-Waters2489高效液相色譜儀(美國Waters公司)；ba410-upr熒光顯微鏡(麥克奧迪實業集團有限公司)；FA2204N 型電子天平(上海民橋精密科學儀器有限公司)；鳥苷對照品(四川維克奇生物科技有限公司)；乙腈、甲醇為色譜純(英國 Thermo Fisher)；乙酸為色譜純(天津市科密歐化學試劑有限公司)。

2 方法

2.1 樣品分級

參照《76 種藥材商品規格標準》[4]，對新疆半夏加工品以大小、單品質量、密度、色澤為指標進行分級。

2.2 半夏加工品水分、總灰分測定

取半夏加工品，分級處理，參照《中華人民共和國藥典》(以下簡稱《中國藥典》)中水分測定法(通則0832第二法)測定半夏藥材的水分，采用灰分測定法(通則2302)測定總灰分。

2.3 顯微鑒別及針晶含量測定

2.4 浸出物、有機酸含量測定

取半夏鮮品，去皮，低溫干燥，粉碎，另取分級后加工藥材，粉碎。水溶性浸出物參照《中國藥典》水溶性浸出物測定法(通則2201)項下的冷浸法測定，總有機酸含量參照電位滴定法(附錄Ⅷ A)測定。為使提取充分完全，有研究表明，熱浸法提取率高于冷浸法[6]。本實驗再對熱浸法使用的溶劑進行了方法學考察，最終采用濃度為50%的乙醇，參照水溶性浸出物測定法(通則2201)中的熱浸出法進行醇溶性成分含量的測定。

2.5 鳥苷含量的HPLC測定

2.5.1 色譜條件 色譜柱XAqua C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；以甲醇∶0.1%乙酸(3∶97)為流動相；檢測波長為254 nm；流速為1 mL min-1；柱溫為室溫；進樣量10 μL。

2.5.2 對照品的制備 精密稱取鳥苷對照品約0.80 mg，加水溶解，定容于25 mL容量瓶中，配制成每1 mL含鳥苷32 μg的對照品溶液。

2.5.3 供試品的制備 取半夏藥材粉末(過四號篩)，精密稱定1.0 g，置150 mL具塞錐形瓶中，加50 mL蒸餾水浸30 min，超聲(240 W，45 kHz)提取40 min，放冷，蒸干，用10 mL水充分溶解，濾過，0.22 μm微孔濾膜過濾，即得供試品溶液。

2.5.4 線性關系的考察 按照2.5.1項下色譜條件，將鳥苷對照品溶液稀釋為3.2、6.4、9.6、12.8、16、19.2、22.4、25.6 μg mL-1，注入高效液相色譜儀，以不同濃度鳥苷為橫坐標，以各成分的峰面積為縱坐標進行線性回歸分析，在其范圍內得回歸方程：Y=26 963X-49 525，r=0.999 7，表明鳥苷在質量濃度3.2～25.6 μg mL-1與峰面積呈良好線性關系。

2.5.5 精密度試驗 取供試品溶液1份，按2.5.1項下色譜條件連續進樣6次，按照其色譜圖峰面積計算RSD值，結果得6次進樣的鳥苷峰面積的RSD值為1.92%，顯示儀器精密度良好。

2.5.6 重復性試驗 精密稱定同一份樣品，制備供試品溶液6份，每份1.0 g，每份供試品溶液按2.5.1項下色譜條件進樣，計算RSD值為1.91%，說明本方法具有良好的重復性。

2.5.7 穩定性試驗 取同一供試品溶液，分別在供試品溶液制備后 0、2、4、6、8、10、12 h 按2.5.1項下色譜條件進樣檢測。RSD為1.48%，表明供試品溶液在12 h內穩定。

2.5.8 加樣回收率 精密稱取鳥苷對照品0.8 mg，置于25 mL量瓶中，用水溶解并稀釋至刻度，搖勻，備用。精密稱取新疆半夏粉末1.0 g，平行9份，加入上述對照品溶液0.8、1.0、1.2 mL各3份，按供試品溶液制備方法操作及上述色譜條件進行測定。計算平均回收率為99.76%，RSD為1.50%。

2.6 數據分析

數據經 Microsoft excel 2010整理后，采用DPS 9.0系統進行新復極差法分析。運用SPSS 18.0 統計軟件進行相關性分析和主成分分析。

3 結果

3.1 樣品分級

對新疆半夏加工品以大小、單品質量為指標進行分級，外觀均呈圓球形、半圓球形，上端圓平，中心凹陷(莖痕)，周圍有棕色點狀根痕，下面鈍圓，較平滑。質堅實。斷面潔白或白色。粉質細膩。氣微，味辛、麻舌而刺喉。無包殼、雜質、蟲蛀、霉變。分級結果見表1。

表1 半夏樣品分級結果

3.2 半夏加工品水分、總灰分含量測定

半夏加工品的水分、總灰分質量分數均不超過的14.0%、4.0%，符合《中國藥典》標準。樣品含量測定結果見表2。

表2 半夏加工品水分、總灰分測定結果 %

注：同一列中不同小寫字母表示差異有統計學意義(P<0.05)。

3.3 顯微鑒別及針晶含量測定

粉末為類白色，淀粉粒極多，單粒類球形或圓多角形，直徑2～20 μm，多數10～15 μm，臍點短縫狀、人字狀或星狀；復粒2～3粒多見，觀察到單粒與復粒之比約為4∶1，草酸鈣針晶較多，散在或成束存在于橢圓形粘液細胞中，長約82～104 μm，另觀察到螺紋導管，長約14～22 μm(見圖1)，與《中國藥典》所述“淀粉粒甚多，直徑2～20 μm，臍點裂縫狀、人字狀或星狀；針晶長20～144 μm，螺紋導管直徑10～24 μm”一致。

新疆半夏鮮品及加工品的針晶含量差異顯著，且新疆半夏鮮品的針晶含量顯著低于甘肅產地。與甘肅半夏加工品相比，新疆二級、三級加工品的針晶含量較低。實驗結果見表3。

表3 半夏針晶含量測定結果

注：同一列中不同小寫字母表示差異有統計學意義(P<0.05)。

3.4 半夏鮮品及加工品的浸出物、有機酸、鳥苷含量測定

實驗測得半夏鮮品及加工品的浸出物質量分數不少于9.0%、有機酸質量分數不少于0.25%，均符合《中國藥典》要求，且加工后新疆半夏藥材的浸出物、有機酸含量均明顯下降，鳥苷含量影響不顯著(表4)。

注：圖片放大400倍；A.淀粉粒；B.螺紋導管；C、D.草酸鈣針晶。圖1 新疆半夏藥材粉末顯微圖

與甘肅半夏鮮品相比，新疆半夏的水溶性浸出物及有機酸含量較高。與甘肅半夏加工品相比，鳥苷含量差異不明顯，但新疆半夏一級加工品的水溶性浸出物、醇溶性浸出物、有機酸含量均較高，二級加工品的醇溶性浸出物及有機酸含量較高，三級加工品的有機酸含量較高(表4)。

表4 半夏浸出物、有機酸、鳥苷含量測定結果 %

注：同一列中不同小寫字母表示差異有統計學意義(P<0.05)。

3.5 相關性分析

對影響半夏品質的5個指標(針晶含量、水溶性浸出物、醇溶性浸出物、有機酸含量、鳥苷含量)進行相關性分析，結果見表5。鳥苷含量與水溶性浸出物、醇溶性浸出物、針晶含量之間差異有統計學意義。

表5 相關性分析結果

注：*P<0.05。

3.6 主成分分析

主成分分析是將多指標簡化為少量綜合指標的一種統計分析方法，用少數變量盡可能多地反映原來變量的信息。選取和半夏品質相關的5個活性成分：針晶含量、水溶性浸出物、醇溶性浸出物、有機酸含量、鳥苷含量，應用主成分分析法對半夏新品及加工品的綜合品質進行排序，從而進行新疆半夏質量的初步評價。5項綜合品質指標有不同的量綱和數量級，為了避免量綱和數量級的影響，對指標數據進行標準化處理，結果見表6。對半夏樣品中5項活性成分含量指標標準化值進行主成分分析，用SPSS統計分析時提取2個主成分，結果見表7，特征值大于1的是前2個主成分PC1、PC2。對于主成分數量的確定要求滿足降維同時又盡可能反應出更多變量地信息，常用累積方差貢獻率(≥85%)來確定主成分的數量，本研究中前2個主成份累積貢獻率為88.75%，適合此方法，可用來評價半夏的質量。結果表明PC1主要反映的是醇溶性浸出物、鳥苷、水溶性浸出物、針晶的含有量信息，PC2主要反映的是有機酸的含有量信息。因此，5個指標(針晶含量、水溶性浸出物、醇溶性浸出物、有機酸含量、鳥苷含量)均可作為評價半夏質量的主要依據，根據不同主成分特征值的方差貢獻率得出綜合評價指標F[7]。對F進行排序，其結果也是對半夏質量綜合評價的結果，見表8。綜合主成分F得分越高，樣品質量越好，可見新疆半夏鮮品質量優于甘肅半夏鮮品，加工后新疆半夏質量下降。

表6 半夏各單項指標的標準化值 %

表7 各因子載荷矩陣、特征值、貢獻率及累積貢獻率

表8 主成分因子得分排序

注：F1為第一主成分得分；F2為第二主成分得分；F為主成分得分總分。

4 討論

本研究建立評價半夏質量的方法，測得新疆半夏加工品的水分、灰分含量值均符合《中國藥典》標準，鮮品及加工品的水溶性浸出物、有機酸含量也符合《中國藥典》標準，質量合格。核苷類成分是半夏藥材及飲片中很重要的有效成分，其中鳥苷含量較高，常作為評價半夏質量優劣的重要依據[8-10]。通過相關性分析，針晶含量與鳥苷含量之間、醇溶性浸出物與鳥苷含量之間均具有顯著(P<0.05)相關性，且有研究發現，半夏水溶性成分有鳥苷、腺苷等，醇溶性成分中有生物堿等活性物質[11]；半夏草酸鈣針晶的含量與其刺激性有關[5]。再結合主成分分析，結果顯示針晶含量、醇溶性浸出物亦可作為評價半夏質量的指標。

與主產區甘肅相比，新疆半夏鮮品的醇溶性浸出物及鳥苷含量無明顯差異，且水溶性浸出物與有機酸含量均較高，表明本評價體系下的新疆半夏鮮品質量較佳。比較加工品的質量，得出新疆一級加工品的鳥苷含量與甘肅加工品間無明顯差異，且針晶、醇溶性浸出物、有機酸含量均較高；新疆二級加工品的針晶、醇溶性浸出物及鳥苷含量與甘肅加工品間無明顯差異，且有機酸含量較高。同時，經主成分分析得出半夏質量的綜合排序，新疆鮮品優于甘肅鮮品。

對分級后新疆半夏加工品的活性成分進行測定，其中，鳥苷含量無明顯差異，但樣品間針晶、浸出物及有機酸的含量差異明顯，有研究表明，半夏中醇溶性及水溶性浸出物等均與半夏的藥理作用關系密切[12]，總游離有機酸具有較強的止咳、祛痰、抗炎作用，體外有抑制腫瘤生長的作用[13]。實驗測得一級半夏加工品的針晶、水溶性浸出物和醇溶性浸出物質量分數分別為1.889 1%、9.785 7%、10.603 2%，二級樣品有機酸質量分數為0.407 4%，均明顯較其他等級樣品高，而三級樣品的針晶、浸出物及有機酸含量較低，鳥苷含量較其他等級的差異并不明顯，說明半夏樣品塊莖大小及質地等在一定程度上影響著化學成分的含量，且經主成分分析進一步得出新疆半夏加工品的質量不一。因此，在以后的實驗分析研究中，應注意樣品分級。

實驗比較了新疆半夏鮮品及加工品的成分含量差異，發現加工后半夏藥材的浸出物、有機酸含量均顯著降低，鳥苷含量損失較少，測得加工后3個等級藥材的水溶性浸出物、醇溶性浸出物、有機酸質量分數平均值分別為9.574 3%、10.308 8%、0.382 7%，相比鮮品下降9.11%、7.73%、7.41%，因此，應進一步研究合適的加工工藝，注意溫度的控制，在產地加工工藝中減少主要成分的流失。

通過對所收集半夏樣品的觀察及查閱相關文獻，比較新疆及其他不同產地栽培半夏的外觀性狀，發現新疆栽培半夏塊莖類球形，且直徑普遍較大，其形狀大部分發生明顯變化，子塊莖比較多。因此，亟需一種評價栽培半夏內在品質差異的方法，以控制半夏的質量，推廣規范化種植技術，保證臨床用藥的安全有效。